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上海市临床检验中心 胡晓波
数十年来，国际血液学标准化委员会（ICSH）先后推荐了血红蛋白测定（J Clin Pathol,1996年），血细胞压积（J Clin Pathol,1980年）和红细胞、白细胞计数（Clin Lab Haematol,1994年）的参考方法。由于种种原因，血小板计数的参考方法直到2001年才正式公布，成为传统CBC计数 校准、确定血液分析仪校准品靶值的可靠依据（Am J Clin Pathol,2001年）。现将ICSH有关血小板计数的参考方法介绍如下。
一、血小板计数参考方法
ICSH曾经推荐过数种血小板计数的侯选方法，如（1）以草酸铵稀释-相差显 微镜法计数血小板；（2）电阻抗法测定RBC/PLT比率。但是，这些方法很难成为准确的、精确的、可靠的血小板计数参考方法， 原因有二：（1）血小板很难与细胞碎片、背景噪音鉴别；（2）大量红细胞会干扰血小板计数。
随着流式细胞仪普及应用，使血小板直接计数成为可能。一系列血小板标志物（包 括静息或激活），如抗CD42，CD41，CD61等单抗，可以标记循环血液中所有血小板，包括独立血小板，黏附于红细胞的血小 板，黏附于白细胞的血小板等，通过恰当稀释，运用流式细胞术能很好将血小板群体分离出来，为准确计数血小板成为可能。
ICSH推荐的间接血小板计数，即采用流式细胞仪计数PLT与RBC相对数量 ，同时采用半自动、单通道、电阻抗颗粒计数仪准确计数红细胞，通过准确和精确的方法，可以确定血液中血小板数量。
（一）、方法学原理
无菌缓冲液预稀释的EDTA抗凝全血，用特异性荧光标记单克隆抗体染色血小板 。溶液中被染色的血小板稀释成计数浓度，在流式细胞仪上根据荧光强度和散射光计数PLT和RBC。通过RBC/PLT比率测定值 ，和准确的RBC计数值就可得出准确的血小板计数值。
（二）、血液标本
EDTA抗凝的新鲜静脉血液标本（3.7-5.4μmol/ml血液），即K 2EDTA（分子量368.4）浓度为1.4-2.0mg/ml血，K3EDTA（分子量442.5）浓度为1.6-2.4mg /ml血。若需同时测定HCT和MCV值，推荐采用K2EDTA抗凝血。标本放置于室温（18-22℃），4小时内处理完毕。
（三）、玻璃器皿
贮存或稀释标本用的容器避免发生血小板黏附，不能采用平底玻璃器皿。推荐采用 聚丙烯或聚苯乙烯材料制成的容器。
（四）、仪器性能
对于红细胞计数和血小板计数，采用能测量前向散射光和荧光的流式细胞仪。仪器 必须有足够的敏感度来分析FITC标记的、直径2μm球形颗粒的散射光和荧光。
对于全血红细胞计数，采用半自动、单通道、电阻抗颗粒计数仪。仪器测量孔必须 直径80-100μm，长度是直径的70%-100%。容积误差1%以内，并可溯源到国家或国际标准。
（五）、试剂
1、稀释液：0.01mol/lPBS，pH7.2-7.4，含1%小牛血清 （BSA）。
2、染色液：FITC直接标记的能识别血小板GPIIb/IIIa复合物2种 表位的单抗：CD41和CD61。商品FITC标记抗血小板抗体有：抗CD61（clone RUU-PL7F12，Becton Dickinson公司）和抗CD41（clone P2，Beckman Coulter公司）。推荐采用双标记染色法.
（六）、操作方法
1、RBC/PLT计数
1）取5μl混合均匀血液加入100μlPBS-BSA稀释液；
2）加5μl抗CD41和5μl抗CD61染色液，孵育15分钟；
3）加入4.85mlPBS-BSA稀释液，使最终稀释度为1:1000倍；
4）计数最少50000个细胞，至少1000个血小板。流速设置小于3000 /秒。若出现红细胞散射光信号，而又有血小板荧光，应考虑RBC-PLT重合误差可能。
采用Quadrant或Bitmap软件分析，推荐采用Bitmap软件分析 。
2、RBC值测定
采用ICSH推荐半自动、单通道、电阻抗颗粒计数仪法计数红细胞。
（七）、血小板计数计算
根据流式细胞仪计数结果，可得出RBC/PLT比率（R）。
R=RBC/PLT；
PLT计数值=RBC计数值/R。
如RBC计数值= ；
PLT计数值= 。
实验研究表明，在357名健康人（包括不同性别和人种），R值为21.572 ±5.134。
（八）、重合误差
一旦试验设定最佳条件，就无需考虑重合误差。但是，在设置过程中，应考虑稀释 、流速等方面因素是否达到监测重合误差可能。
（九）、不精密度
标本中细胞数量决定了统计学计数的变异程度。公式如下：
，其中Nplt为流式细胞仪计数的血小板数，Nrbc为流式细胞仪计数的红细胞数；由于流式细胞仪计数的红细胞数相当于总流式细 胞仪计数值（Ntotal），而Nplt=Nrbc/R，所以，
按照上述研究表明，R平均值为20左右，Ntotal为50000，流式细胞 仪计数血小板的统计学精度就可达2%左右。实验同样也证明，血小板计数为 ，方法学精度为1.7-3%。
（十）、干扰
虽然单克隆抗体标记方法在大部分标本中是有效的，但也会产生干扰。
(十一)、评价
经法国、英国、美国、日本等11个实验室运用抗CD41和抗CD61染色方法 对血小板计数研究显示，该方法的实验室内精度和实验室间精度很好。该法可以替代原来颗粒计数法，适用于自动血液分析仪的校准，尤 其是血小板计数减少标本，测定结果的准确性很高。
二、血液学质量保证
对于临床实验室来说，其提供服务有3个目的：（1）实验室检查结果必须准确； （2）所进行实验对疾病诊断、疗效观察、普查或流行病学研究有价值；（3）实验室必须快速、有效、经济的提供结果。为了达到上述 目标，实验室从管理者到操作人员的工作都必须纳入质量保证体系中。
血液学实验室的质量保证计划由4部分组成，（1）内部质量控制；（2）外部质 量评价；（3）分析前和分析后控制和（4）标准化问题。
（一）、质量保证计划
每个实验室必须建立自身质量保证计划。每个试验可根据不同实验要求，建立相应 质量保证模式，包括内部质量控制和参加EQA调查。
1、内部质量控制
质量保证计划中应考虑实验室设备，场地、人员技术水平，每日标本量等因素。
1）全天候纠正系统：累积报告模式，血涂片纠正细胞计数、纠正细胞计数与临床 变化关系。
2）每日：每批标本做质控；质控结果制成质控图；病人标本重复测试；病人标本 的delta试验；部分参数每日均值计算，如自动计算MCV、MCH、MCHC，或手工计算MCHC。
3）间隔性（每日或每周）
校准血细胞计数仪和血红蛋白测定仪。
（1）血红蛋白：氰化血红蛋白参考制品，溶血液。
（2）红细胞：贮存血，质控血。
（3）白细胞：质控人血，禽类血液。
（4）血小板：质控人血小板制品
4）间断性（首次和再次）
校准移液器和自动分注器。
5）间断性（首次和重复，至少6个月）
校准比色计和分光光度计。
2、外部质量评价（EQA）
目标是达到实验室间结果的可比性，当然通过一个或多个参考实验室测定结果，可 以提供准确的结果，即提供参考值。
大多数实验室都有参加地区性或局域性质量评价的计划。但是，实验室内部也可以 组织开展比对试验，属于局限性质量评价。
必须记住，虽然IQC和EQA非常重要，但也只能反映实验室性能的某一方面， 实验室分析前和分析后的质量同样重要。
（二）、内部质量控制（IQC）
1、病人标本的重复试验
是一种最简单方法，如果每日工作量允许，每个标本均可做双份测定；如果标本量 太多，可对少数（4-5个）结果进行重复测定。计算公式如下：
其中， =重复测定结果差值的平方；n=重复试验的标本数。
解释：重复试验每个标本的测定结果不能超过2s，是鉴别随机误差方法。若实验 结果s很大，该方法就不够敏感。
2、核查试验
与重复试验相似，但使用的是原先检测的一批标本。
解释：试验结果必须在2s以内。能检出检测过程中仪器和试剂变质情况。这些实 验适于Hb、RBC分析，不太适于WBC和PLT分析，不适于PCV分析，因为这类标本放置时间不能超过6小时。
3、Delta试验
指同一病人当前结果与近期原先结果比较。不适用于经治疗病人或临床导致结果变 化的情况。考虑昼夜节律变化时，计数中相对大的差异必须引起注意。
4、质控标本的重复试验
单个标本的重复测定将确定重复性误差（精度），是评价技术好坏或仪器不稳定的 方法。适用于任何血液标本，但是最适于质控物，可得出重复测定结果s，然后用于质控图的制作。
解释：结果的s和CV提示精密度。精度水平表明测量操作的这种误差不会明显影 响临床结果判断。如当血红蛋白水平比原先下降10%后临床可诊断出血，就要求该方法的CV小于5%，意味着测量s不能大于4g（ 80g/L）或8g（160g/L）。
对于某些试验，如血细胞计数板计数RBC，是不能达到预期精度水平，CV通常 为10%。而采用自动血细胞分析仪精度可达2%左右，仪器就具有很高精度。
5、质控图
根据质控物均值和s（溶血液或质控血），临床实验室可制备L-J质控图。通常 横座标代表天数或批数，纵座标代表±2s或3s。
失控见于系统误差。如更换新批号试剂。当更换试剂后，应重新建立质控图。
解释：试验结果在控，所有测量结果均可报告。质控规则如下：
（1）1个控制值超过±2s，警告；
（2）1个控制值超过±3s，失控：随机误差或系统误差；
（3）2个连续控制值超过±2s，失控：系统误差；
（4）4个连续控制值超过±1s，失控：系统误差；
（5）6个连续控制值超过1侧均值，警告：系统误差。
应记住的是，失控后首先检查质控物本身是否被污染或变质。
6、累积和（CUSUM）控制
这是显示试验精度的方法。CUSUM是测定值和均值之间的总差异，表明技术或 设备有缺陷的较敏感方法。可用于检出持续性变化，如漂移或倾向。
7、病人标本
在大医院，若每日血液分析标本数量超过100份，天间或周间红细胞指数均值变 化（MCV、MCH和MCHC）不会有明显差异。适于使用自动血细胞分析仪的实验室，当结果发生明显改变时，应校准仪器。较复杂 自动血细胞分析系统都有计算机程序帮助分析连续测定数据。
同样采用相似原理的手工方法是计算MCHC。每日计算所有测定结果MCHC均 值，正常情况下，均值不会超过任何1天的2s。采用此方法需先计算s，一般是计算11个工作日的连续测定结果的s，
8、纠正核查
任何未预测到的结果，实验室必须核查临床资料或用其他试验来纠正结果。例如， 血红蛋白异常增高或减低，应考虑输血或出血。低MCHC值应在血涂片上可见低色素红细胞；高MCV值与大细胞增多有关。同样，血 涂片也能证实白细胞增多或白细胞减少，血小板增多或血小板减少，但必须注意血涂片也可能导致错误。
（三）、外部质量评价
即使实验室内开展的室内质量控制已能取得可靠得结果，但只有室间评价是检出系 统误差最好方法，也是使结果具有可比性的重要方法。外部质量评价得结果统计处理方法如下：
将参加者的结果，计算均值或中位数和s。除去2s外数据，再计算均值和s。若 采用中位数，s等于中央50%÷1.35。
为了使计算的s有意义，每组至少有15名参加者，且至少一半参加者质量优良， 避免影响加权s。
计算每个参加者的"偏离指数"（DI），也就是"z积分"。表明单个实验室与 其他实验室加权均值或中位数的差异。 结果解释：
<1.0=性能满意；
1.0-2.0=仍可接收，但临界；
2.0-3.0=需要复查技术，校准核查；
>3.0=有缺陷，需要改正。
上述是实验室质量保证体系中几个重要环节，其他影响质量因素，如分析前，分析 后，实验室内规程，仪器设备、原辅材料采购、使用，和标准化等都是血液学质量保证体系中应考虑问题。 | 
