[转帖]COULTER GEN'S SOP文件--原理和应用

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Gen.s II原理和临床应用	版序：2005-1
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一．库尔特原理及技术 (一)库尔特原理 库尔特原理是利用电阻抗法测量细胞的数量和体积。其内容为：血细胞是电的不良导体，当一个细胞通过计数小孔时，会导致小孔两端电阻的变化，将其转化成脉冲，感应器通过检测脉冲的数量及大小，从而计算出通过小孔的细胞数量及体积。 细胞计数池中，小孔内外两个电极和稀释液构成一个电流回路，在负压的作用下，细胞通过小孔，电极能感应到一个瞬间的电阻变化，并将其转换成脉冲，脉冲的数量代表细胞的数量，脉冲的大小反映细胞的体积大小。 利用库尔特原理，能够对白细胞计数；对红细胞和血小板根据体积进行区分并分别计数。  (二)参数的推导 1.白细胞计数 白细胞结果通过直接计数得到。在白细胞计数池，所有大于35fL的细胞颗粒都被计数为白细胞，虽然红细胞大小相似，但已被溶血剂溶解，而血小板体积绝大部分小于35fl下限，可忽略不计。仪器根据校正因子计算并报告白细胞结果。         2.血红蛋白 血红蛋白是直接测量参数，在白细胞计数池加入红细胞溶血剂，溶解红细胞，释放血红蛋白，并转化成稳定的氰化高铁血红蛋白，其浓度与吸光度成正比。在525nm波长下，根据吸光度值，计算血红蛋白浓度。 3.红细胞 (1)红细胞计数 红细胞数量是直接测量参数。在红细胞/血小板计数池中大于或等于36fl的颗粒将被计数作红细胞。但混合液中包括红细胞、白细胞和血小板，血小板体积较小，通
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过阈值的设定可将其区分，混合液里的白细胞被计数在红细胞内，但白细胞的含量对红细胞来说是微乎其微的。仪器通过校正后，计算出红细胞数值。     (2)平均红细胞体积(MCV) 平均红细胞体积由红细胞直方图推导，它是红细胞直方图在36fl～360fl范围内所有细胞体积的平均值，是红细胞大小的参数。     (3)红细胞分布宽度(RDW)     红细胞分宽度是反映红细胞间体积差异的参数，由直方图推导。在直方图上去除曲线的两个极端，由剩余曲线计算红细胞体积大小的CV值。其计算公式：                    RDW=  SD × 100%                                  平均体积     (4)红细胞比积(Hct) 红细胞比积是计算参数，它是以百分率表示的红细胞的近似体积。 计算公式：                   HCT=  RBC×MCV                                        1L      (5)平均红细胞血红蛋白含量(MCH) 平均红细胞血红蛋白含量是计算参数，表示各个红细胞血红蛋白含量的平均值。计算公式：                  MCH=  HGB(g/L)×1012pg                                      RBC(L－1)     (6)平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)     平均红细胞血红蛋白浓度指测红细胞比积时被压紧的红细胞的血红蛋白浓度，
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计算公式：                  MCHC=  HGB/L                         Hct 4.血小板 (1)血小板计数     血小板数量由血小板直方图推导，在红细胞/血小板计数池中计数2fl～20fl的颗粒，再用电子拟合曲线拟合出0fl～70fl范围的所有血小板数量。     (2)血小板平均体积(MPV)     这一参数是由血小板直方图推导的，是血小板体积大小的参数。     二．            细胞VCS五分类技术 库尔特运用VCS技术对白细胞进行五项分类，运用V、C、S三种探针，在流式通道的检测点，对通过的单列白细胞进行逐个的、同时的、三重的检测，用三维分析技术直接分类白细胞各亚群。     库尔特白细胞分类用Scatterpak试剂包，内含两种试剂：一种是溶血剂，另一种是稳定剂。分析时仪器先加入溶血剂，溶解红细胞，再加入稳定剂，使白细胞恢复到原态，进入流式通道接受检测。 在流式通道内运用流体动力聚焦技术，以ISOTON III作为鞘流，令其在流式通道内作最适的单细胞排列，逐个、同时地接受VCS三重检测。 VCS技术运用V、C、S三种探针，从体积、细胞核特性、颗粒特性等方面综合分析白细胞，检测细胞的视角与手工镜检相似。 1．用低频电流准确分析细胞体积，是库尔特专利技术。 体积是区分白细胞亚群一个很重要的参数，它能有效区分淋巴细胞和单核细胞。
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2．Conductivity-Opacity(传导性-阻光性) 运用高频电磁探针检测细胞核及核质比的特性，是库尔特专利技术。 细胞膜对高频电流具传导性，当电流通过细胞时，细胞核的化学组份令电流的传导产生变化，其变化量(RF)可以用来反映细胞内含物的信息。 该参数可用来进一步区别体积差不多的细胞，如：淋巴细胞和嗜碱细胞，由于它们的细胞核特性不同而在传导性参数上有所区别。 3.Light Scatter-RLS(激光散射) 运用一个氦氖激光源发出的单色激光扫描细胞，收集细胞在10O～70 O的散射光(MALS)，提供关于细胞颗粒性的信息。可以很好地区分颗粒特性不同的细胞。 4.三维分析 仪器将检测8,192个白细胞，根据每个细胞的V、C、S检测量，将它们分布到一个VCS三维坐标(分辨率为256×256×256=16,777,216)上，得到白细胞各亚群的分布区，其分辨率是至今为止最高的。高分辨率不仅令五项分类清晰，还可以提示许多异常细胞区域的报警。 三．            网织红细胞检测原理 网织红细胞是介于晚幼红细胞和成熟红细胞之间的不成熟红细胞，通常较成熟红细胞稍大，其胞质中尚残存部分嗜碱性物质(RNA、核糖体)，经碱性染料染色后可见深染的网状结构，故名。 库尔特网织红细胞检测试剂分A液和B液：A液是新亚甲蓝染液，用以着色网织红细胞中嗜碱性物质；B液是漂洗液，用以漂去成熟红细胞的血红蛋白。在流式通道中，运用VCS三维技术分析染色后的网织红细胞：低频波检测细胞体积，网织红细胞比成熟红细胞稍大；高频波(阻光性)检测细胞的内部成分，可剔除非红细胞；激光散射将网织红细胞与成熟红细胞区分开来，因为网织红细胞胞浆含嗜碱性物质
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物质，结合染料后散射较多的激光，在散点图上分布于红细胞的右侧，网织红细胞成熟度越差,在散点图上分布越靠右。                                                                 四．            血细胞直方图 (一)直方图的导出 在细胞通过小孔计数时，感应器收集脉冲的大小及数量，转换为相应的细胞体积和数量，并在坐标上表示出来。坐标的横轴(X)代表体积(fL)，纵轴(Y)代表数量，将各点用光滑的曲线相连，就是直方图。 (二)红细胞直方图         红细胞的直方图上，X轴体积的显示范围从24fl～360fl，仪器将大于36fl的颗粒计数为红细胞，24fl～36fl一段用于监测有否36fl以下的小红细胞被漏计。         在红细胞直方图上可以看到两个细胞群体：一个是红细胞主群，从50fl开始，是一个两侧对称、呈现倒扣钟状的正态分布曲线；另一个是小细胞群，位于主群右侧，约分布在130fl～185fl区域，又称“足趾部”，是一些红细胞的二聚体、三聚体、多聚体及白细胞的混合物。     在红细胞七个参数中，有两个参数的检测与红细胞直方图有关，是MCV和RDW。MCV表示红细胞平均体积，它与红细胞峰顶落在X轴的位置有关，MCV变大，红细胞峰右移；MCV变小，红细胞峰左移。RDW是一个反映红细胞大小变异性的参数，名称是红细胞分布宽度。它的统计学实质是红细胞大小的变异系数(CV)，在MCV相似的情况下，RDW越大，红细胞峰就越宽。临床上可根据MCV和RDW来对红细胞疾病进行分类。

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(三)血小板直方图     典型的血小板直方图，呈现对数正态分布，通常包含两条曲线：一条是2fl～20fl的原始数据曲线；另一条是0fl～70fl的拟合曲线。血小板的大小分布在0fl～70fl范围，但绝大多数血小板在2fl～20fl范围，     而血小板计数的干扰主要来自2fl以下的噪音和细菌的干扰及 20fl以上的裂红细胞、小红细胞和白细胞的干扰。故而仪器计数2fl～20fl的血小板，再拟合出一条0fl～70fl 的曲线，将少部分的小血小板和大血小板统计在内，有效排除干扰。             但拟合曲线的给出有4个条件： 1.血小板计数 > 20×1012/L； 2.直方图呈现正态分布； 3.直方图的峰值在3fl～15fl范围； 4.PDW < 20%。     二．            旗标和代码的临床意义 样本结果后会出现旗标和代码，旗标常出现在结果数值后，而代码常代替结果。常见的旗标有：*(代表仪器计数阈值处受干扰)、R(代表结果须复核)、+(结果超出线性范围)、H(代表结果高于H/L范围上限)、L(结果低于H/L范围下限)；常见的代码有：…..(代表不完全计数或吸样错误)、-----(代表三次计数不统一)、P(代表部分吸样)、+++++(代表结果超出操作范围)、:::::(代表流式通道有阻塞)。 1.*(多见于白细胞计数结果后) 含义：说明白细胞在35fl处的检测受到干扰。在白细胞计数孔有35fl大小的颗粒通过并被当作白细胞计数，且超过一定数量，触发报警。在白细胞直方图上看，曲线在35fl处上抬。
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导致出现的原因：小白细胞、有核红细胞、冷球蛋白、抗溶红细胞、小巨核细胞、红细胞聚集、大血小板、血小板聚集、溶血剂输送系统故障等。     2. RDW后出现 R         含义：红细胞计数时仪器计数 24fl～ 360fl的颗粒，绘出直方图，正常红细胞直方图应为两端封闭、单峰、呈高斯分布的曲线。RDW反应红细胞大小分布的偏离情况，其意义相当于 CV%(变异系数)。RDW后出现R说明红细胞直方图出现异常，如直方图非正态分布、出现双峰等。     导致出现的原因：输血、红细胞凝集、红细胞碎片、大血小板、血小板凝集成块等。         3.PLT结果后出现R 含义：仪器进行血小板计数时，计数 2fl～ 20fl大小的血小板颗粒数量，再拟合出一条 0fl～ 70fl的曲线，将小部分小血小板及大血小板包含进去，目的是为了排除计数干扰。但拟合曲线的给出是有条件的(详见血小板直方图的说明)，条件不满足时仪器不能给出拟合曲线，这时候血小板数值后出现 R 。 导致出现的原因：小红细胞或红细胞碎片、白细胞碎片、冷球蛋白、大血小板、血小板凝集、卫星血小板、血小板大小不一(输血后)、电磁波或噪音干扰小孔计数等。 4.+++++ 含义：结果超出仪器的操作范围，对白细胞而言计数值大于 500×109/L；对血小板而言计数值大于 2500×109/L。 5.+ 含义：结果超出仪器的线性范围，对白细胞而言大于140×109/L；对血小板而言大于1500×109/L。
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6．----- 含义：代表三次计数不统一。血球仪将对细胞的计数进行三次计数，如果三次计数值统一，仪器将取平均值报告最后结果；如果三次中有两个结果统一而另一次相差较大，仪器将取两次的平均值；如果三次结果都不统一，仪器将报告-----。 导致出现的原因：小孔堵塞或部分堵塞、标本有凝块或丝状纤维蛋白、白细胞聚集,红细胞凝集、大血小板,血小板凝集、标本稀释后未气泡混匀等。 7． …… 含义：出现表示数据不完整，不完全计数。通常当一个参数由于三次计数不统一或超过范围得不到确切数值时，其衍生参数后将出现 …… , 如WBC后出现 +++++ ，则其衍生参数NE#、 LY #、 MO #、 EO #、 BA # 后将出现 ….. 。 ……自动进样时也可表示吸样错误，当发生吸样错误时，所有参数的结果后都会带有 ……。 导致出现的原因：样本有凝块,堵塞吸样针、样本量不够、样本的RBC和HGB浓度过低(严重贫血病人标本),血样探测器检测失败、仪器吸样系统堵塞。 8． ::::: 含义：在白细胞五项分类及网织红细胞计数中，当流式通道堵塞产生 ::::: 代码， 在散点分布图上可有三种堵塞报警：FC表示流式通道完全堵塞(无检测)；PC1表示流式通道检测时间延长；PC2表示流式通道检测时间缩短。 导致出现的原因： (1)FC ：完全堵塞； (2)PC1 ：流式通道或标本通道部分堵塞导致分类时间延长； (3)PC2 ：红细胞未完全溶解导致分类时间缩短，或鞘液系统问题。临床上高胆固醇和高甘油三酯血症、血红蛋白病、药物治疗后、进行性肝病等都可导致 PC2。
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三．            怀疑性旗标和限定性旗标 出现在散点图下方的旗标框内，针对白细胞、红细胞和血小板出现不同的旗标。 1.白细胞怀疑性旗标 (1)NE Blasts (原始粒细胞)、LY Blasts(原始淋巴细胞)、MO Blasts(原始单核细胞) (2)Imm  NE 1(未成熟粒细胞1) (3)Imm  NE 2(未成熟粒细胞2) (4)Variant Lymphs(异型淋巴细胞) (5)Review Slide(涂片复检) 2.白细胞限定性旗标 (1)Leukopenia (白细胞减少) ：白细胞计数低于设定的下限 (2)Leukocytosis (白细胞增多) ：白细胞计数高于设定的上限； (3)Neutropenia (中性粒细胞减少)：中性粒细胞的数值或百分比低于设定的下限； (4)Neutrophilia (中性粒细胞增多)：中性粒细胞的数值或百分比高于设定的上限； (5)Lymphopenia (淋巴细胞减少)：淋巴细胞的数值或百分比低于设定的下限 ； (6)Lymphocytosis (淋巴细胞增多)：淋巴细胞的数值后百分比高于设定的上限； (7)Monocytosis(单核细胞增多)：单核细胞的数值或百分比高于设定的上限； (8)Eosinophilia(嗜酸细胞增多)：嗜酸细胞的数值或百分比高于设定的上限；     (9)Basophilia(嗜碱细胞增多)：嗜碱细胞的数值或百分比高于设定的上限。

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3.红细胞怀疑性旗标 (1)NRBCs (有核红细胞) (2)Dimorphic RBC Pop (红细胞双峰) (3)Micro RBCs/RBC Fragments (小红细胞/红细胞碎片) (4)RBC Agglutination (红细胞聚集) 4.红细胞限定性旗标 (1)Anemia(贫血)：红细胞数值或血红蛋白量低于设定的下限； (2)Anisocytosis(红细胞大小不一)：RDW高于设定的上限，根据程度的不同有1+、2+、3+； (3)Microcytosis(小红细胞症)：MCV低于设定的下限，根据程度的不同有1+、2+、3+； (4)Macrocytosis(大红细胞症)：MCV高于设定的上限，根据程度的不同有1+、2+、3+；     (5)Hypochromia(血红蛋白含量降低)：MCH低于设定的下限，根据程度的不同有1+、2+、3+； (6)Poikilocytosis(红细胞畸形)：RDW高于上限而MCH低于下限，根据程度的不同有1+、2+、3+； (7)Erythrocytosis(红细胞增多症)：红细胞数值高于设定的上限； (8)Pancytopenia(全血细胞下降)：白细胞、红细胞和血小板数值都下降。 5. 血小板怀疑性旗标 (1)Platelet Clumps (血小板聚集) (2)Giant Platelets (巨大血小板)
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6. 血小板限定性旗标 (1)Thrombocytopenia(血小板减少症)：血小板数值低于下限； (2)Thrombocytosis(血小板增多症)：血小板数值高于上限； (3)Small Platelets(小血小板)：MPV低于下限； 七.稀释器包含了仪器的管路系统。稀释器键盘执行稀释器功能、向主机输入数字。 -        [ALARM RESET]：    停止报警声音。 -        [PREMIX]：     吸样前标本在摇床预摇匀一分钟。 -        [0]-[9]：      输入0～9的数字。 -        [START/CONT]：     开始自动进样检测。 -        [SHUT DOWN]：      执行关机冲洗程序，并检查废液量。结束后自动关闭气泵。 -        [CLEAR APERT]：    对小孔进行逆向加压冲洗。 -        [STOP] ·        如果正在分析标本：当前标本分析结束，不再继续分析；重新开始按[START/CONT]； ·        如果正在摇床混匀：停止混匀； ·        如果正在执行F功能：退出F功能； ·        按2次：释放stripper plate； ·        不能停止STARTUP和SHUTDOWN循环。 -        [POWER ON]：       打开主机电源，并进行系列程序。程序结束，稀释器屏幕 和分析器屏幕显示REDAY。其中重要的程序有： ·        检查试剂和废液，发现问题稀释器键盘报警并停机。 ·        显示仪器版本 -        [POWER OFF]：      关闭主机电源。 -        [DRAIN]：      将2个计数池、血红蛋白池、和负压池排空至废液池。结束 时，稀释器屏幕显示REDAY。 -        [RINSE]：      向2个计数池注入稀释液；同时将废液池排空。 -        [START UP]：   执行开机冲洗程序，包括冲净清洁剂、充盈各类试剂、系    统自检。
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-        [PRIME APERT]：    顺冲小孔，赶走管道内的气泡。 -        [ENTER]：      确认输入。如在执行F功能或输入标本ID时。再按，表 示重复执行刚才的F功能。 -        [F]：          组合一组F功能键。 -        [ID]：         手工进样时，输入样品编号用（[ID]+编号） -        [CE]：         在[ENTER]之前，取消输入。[ENTER]之后，要[STOP]停止， 或按分析器的[Reset]键。如操作F功能键或输入标本编号时。 -        [.]：          小数点。 部分 F 功能键： -        [F][0][1][ENTER]： 灼烧小孔1次 -        [F][0][9][ENTER]:  灼烧小孔10 次 -        [F][4][4][ENTER]： 流式通道清洁程序1 -        [F][4][5][ENTER]： 流式通道清洁程序2 -        [F][4][6][ENTER]： 流式通道清洁程序3(谨慎使用) -        [F][1][1][ENTER]： 延长灌注功能 -        [F][0][2][ENTER]： 充盈白细胞计数溶血剂 -        [F][1][6][ENTER]： 充盈稀释剂 -        [F][1][7][ENTER]： 充盈清洁剂 -        [F][1][4][ENTER]： 充盈分类溶血剂 -        [F][1][5][ENTER]： 充盈分类终止剂 -        [F][1][8][ENTER]： 充盈网织红细胞试剂包的染色液 -        [F][1][9][ENTER]： 充盈网织红细胞试剂包的漂洗液 -        [F][6][7][ENTER]： 启始充盈，灌注除清洁剂外的所有试剂 -        [F][3][1][ENTER]： 试剂池充盈 -        [F][0][8][ENTER]： 充盈扫流管 -        [F][5][5][ENTER]： 做分类的乳胶质控 -        [F][5][6][ENTER]： 做网织红细胞的乳胶质控 -        [F][5][7][ENTER]： 做分类 + 网织红细胞的乳胶质控 -        [F][0][6][ENTER]： 松弛分血片 -        [F][0][3][ENTER]： 混合红细胞和白细胞的计数池 -        [F][9][6][ENTER]： 传送带测试 -        [F][2][8][ENTER]： 擦针器测试