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血液标本的采集和抗凝 一. 毛细血管采血 操作 1. 采血部位成人以左手无名指为宜, 半岁以上儿童手指为好, 半岁以下婴 幼儿通常自拇指或足跟采血. 2. 轻轻按摩采血部位,使其自然充血,用 75%乙醇棉球消毒局部皮肤待干. 3. 紧捏刺血部位,用无菌采血针穿刺取血动作应迅速,深度约2-3mm,以稍加 挤压血液能流出为宜。 　 4. 用干棉球擦去第一滴血,按需要依次采血. 5. 采血完毕,用于棉球压住伤口片刻. 注意事项: 1. 耳垂采血要避开冻疮, 发炎, 水肿等部位, 以避免影响结果. 2. 进行多项检查时,采血标本次序为血小板计数, 红细胞计数, 血红蛋白 测定白细胞计数等,出血时间需另刺一针,进行观察.凝血时间需另行测定. 二. 抗凝剂的选用 临床检验常用的抗凝剂有以下三种: (一) 掬橼酸钠(trisodijum citrate): 掬橼酸盐可与血中钙离子形成可溶性鳌合物, 从而阻止血液凝固. Na3C6H5O7＋Ca++─CaC6H5O7＋3Na+ 枸橼酸钠有Na3C6H5O7.2H20和2Na3C6H5O7.11H2O等多种晶体, 通常用前者配成106mmol/L(31.3g/L)水溶液(也有用109mmol/L的浓度)与血液按1:9或 1:4比例使用. 枸橼酸钠常用于凝血象和红细胞沉降率的测定. 因毒性小, 也用于输血保养液中. (二) 肝素(heparin): 肝素是一种含硫酸基团的粘多糖, 分子量为15000, 带强大的负电荷, 具多方面抗凝作用, 主要对抗凝血活酶和凝血酶的形成和活性, 阻止血小板聚集. 通常用肝素粉剂(每mg含100-125u)配成1g/L水溶液, 每ml含肝素1mg.取0.5ml置小瓶中, 于37-50C烘干后能使5ml血液不凝固. (三 ) 乙二胺四乙酸(EDTA)盐 EDTA有二钠,二钾,三钾盐, 均可与血中钙离子结合成鳌合物, 从而阻止血液凝固. Na2C10H14O8N2＋Ca++─CaC10H14O8N2＋2Na+＋2H+ EDTA盐经100c干燥, 抗凝作用不变. 通常配成15g/L水溶液, 每瓶0. 4ml,经干燥后可抗凝血液5ml. EDTA盐对血细胞形态和血小板影响很小, 因此适用于血液常规检查, 特别是血小板计数. 但影响血小板聚集和白细胞吞噬功能,不适用于作凝血象检查和血小板功能试验. 附注:物理抗凝法 将血液注入含有适量玻璃珠的三角瓶中徐徐摇动, 使纤微蛋白全部粘附在玻璃珠上. 亦可使血液不再凝集, 用本法分离的抗凝血为脱纤维蛋白血. 血红蛋白测定 氰化高铁血红蛋白(HiCN)法 原理: 全血加HiCN试剂, 除Hbs及HBC外其他血红蛋白衍生物均能转化成稳定的棕红色氰化高铁血红蛋白, 在分光光度计540nm处比色测定, 根据标准读数和标本读数计算其浓度. 在有条件的单位, 可根据其摩尔消光系数计算含量. 试剂: HiCN试剂的配法 　　氰化钾 50mg 　　高铁氰化钾 200mg 　　无水磷酸二氢钾 140mg 　　Trition X-100(或其他非离子型表面活性剂如乳化剂OP,Tween80等)1.0ml. 　　蒸馏水 加至100ml 此液为淡黄色透明液体, 用蒸馏水调零,波长540nm处的吸光度应为零. 贮　放在棕色瓶中, 放冰箱保存. 操作 1. 取血20ml, 加到5mlHiCN试剂中, 充分混和, 静置5分钟. 2. 分光光度计(带宽应小于 8nm), 波长540nm处, 光径(比色杯内径) 1.000cm, 以HiCN试剂或蒸馏水液为空白, 测吸光度(A). 3. 计算 血红蛋白(g/L)=测定管吸光度x64458/44000x251=测定管吸光度x367.7 式中: 1)64458是目前国际公认的血红蛋白平均分子量 2)44000是1965年国际血液学标准化委员会(ICSH) 公布的血红蛋白　　　　　　摩尔吸光度 3)251稀释倍数 由于仪器的差异, 性能不一, 任以采用HICN参考标准液绘制标准曲线的方法为妥, 以血红蛋白参考值为横坐标, 以吸光度为纵坐标, 绘制曲线, 实际应用比较方便. 参考值: 男: 120-160g/L(12-16g/dl) 女: 110-150g/L(11-15g/dl) 新生儿: 170-200g/L(17-20g/dl) 附注: 1) 血红蛋白测定方法很多, 但无论采用哪一种方法, 都必须以HiCN法标本绘制标准曲线. 2) HiCN法结果准确可靠,操作也简便, 但试剂中KCN为剧毒药用于日常大量标本应注意废液处理, 可用Fe2SO43消毒 临床意义: 生理性增加: 新生儿 高山居住者 病理性增加: 真性红细胞增多征, 代偿性红细胞增多征( 如先天性心脏病, 漫性肺脏疾病, 脱水) 减少: 各种贫血, 白血病, 产后, 手术后, 大量出血. 红细胞计数 原理: 用等渗稀释液将血液稀释并充入计数池后, 于显微镜下计数. 试剂: 　 赫姆氏液(Hayem): 　氯化钠(NACL) 1.0g 　 结晶硫酸钠(Na2SO4.10H2O) 5.0g (或无水硫酸钠2.5g) 氯化高汞 0.5g 蒸馏水 加至 200ml 溶解后加2%伊红水溶液1滴, 过滤后用. 操作: 1.取小试管一支, 加红细胞稀释液压1.99ml 2. 自指尖采血, 擦去第一滴血后, 再使流出血液形成较大的血滴, 勿 过分挤压. 3. 用一次性消毒微量吸管取血10ml. 4. 擦去管坚外部余血, 轻轻吹入红细胞稀释液底部, 再轻吸上部 清 液, 洗吸管2-3次, 然后立即混匀. 5. 充池后待2-3分钟, 用低倍镜依次计数中央大方格内四角和正中五 个大方格内的红细胞 计算 5个中方格内的红细胞数×5×10×200×106=红细胞数/L 参考值: 男: (4-5.5)×1012/L (400万-550万/uL) 女: (3.5-5)×1012/L (350万-500万/uL) 新生儿:(6-7)×1012/L (600万-700万/uL) 临床意义: 增加或减少见血红蛋白测定. 一般情况下红细胞数与血红蛋白浓度之间　有一定的比例关系，但在部分贫血患者同时测定二者，对贫血诊断和鉴别诊　断有帮助。 红细胞比积测定 　一　温氏管法（wintrobe） 原理： 　　红细胞比积（PCV或HT）是指红细胞在血液中所占容积的比值。 通常将定量的抗凝血液用一定的速度和时间离心沉淀后，观察压实红细胞和上层血浆体积的比值（L/L) 试剂: 干燥 EDTA-K2,3mg,分装在小瓶中,能抗凝2ml血液. 操作: 1.静脉采血2ml,立即注入抗凝瓶中,混匀. 2.用细长毛细滴管吸取混匀的抗凝血,插入红细胞比积管(温氏管,110X2.5-3mm 平底厚壁玻管)底部,然后将血液缓慢注入至刻度"10"处, 注意防止气泡产生. 3.水平离心机以3000r/min速度离心30分钟, 读取压实红细胞层柱高的毫米数, 再离心10分钟, 至红细胞不再下降为止, 乘以0.01即为每L 血液中红细胞体积L数, 以L/L单位报告结果. 参考值 男 0.42-0.49/L (42-49%) 女 0.37-0.43/L (37-43%) 附注: 1.EDTA-K2抗凝效果好, 室温48小时红细胞体积不变, 符合本试验要求. 2.上层血浆如有黄疸及溶血现象(排除种种因素)应予注明, 供临床医师参考. 临床意义 1 增高:大面积烧伤, 体外循环脱水等 2 减低:各类贫血时, 随红细胞数的减少而有程度不同的降低 二 毛细管法 原理: 同温氏法 器材: 1 微型高速离心机 2 微量毛细管 3 静脉血(EDTA-K2抗凝) 操作: 1. 用虹吸法将静脉血充进2支毛细管内 2. 将毛细玻管按号码放在专用红细胞比积高速离心机相应位置上, 关好盖 子,离心3500r/3min 3. 到时自动停机后, 直接在刻度离心盘上读出红细胞比积. 参考值: 男: 0.467±0.039， 女: 0.421±0.054 临床意义: 同温氏法 注意事项: 1 毛细管充血时不能进入气泡 2 刻度离心盘要干净, 不能有残血 3 离心盘胶垫要有弹性, 避免毛细管密封不好, 出现血液遗漏. 4 毛细管放入刻度离心槽中要按平, 以防血液遗漏. 5 如发生血液遗漏, 请清洁后重新操作. 6 注意离心机电池是否有效. 三种红细胞平均值的计算 原理 根据红细胞血红蛋白浓度, 红细胞比积, 计算红细胞平均容量, 红细胞平均血红蛋白量, 红细胞平均血红蛋白浓度, 用作贫血的形态学分类. 计算方法: 1 红细胞平均容量(mean corpuscular volume MCV): MCV是指每个红细胞平均体积, 以飞升为单位(fl). MCV=每升血液中红细胞体积(L)X1015/每升血液红细胞浓度数(个)=fl IL=1015fL 举例: 红细胞 3.6X1012/L, 红细胞比积0.392L/L mCV=0.392X1015/3.6X1012=109FL 2 红细胞平均血红蛋白量(mean corpuscular hemoglobin MCH): MCH是指每个红细胞内所含血红蛋白平均量, 以皮克(pg)为单位. MCH=每L血液中血红蛋白浓度(g)X1012/每升血液红细胞浓度(个)=pg 1g=1012pg 举例:红细胞3.6X1012/L 血红蛋白13.6g%(136g/L) MCH=136g/L/3.6X1012=38pg 3 红细胞平均血红蛋白浓度(mean corpuscular hemoglobin concentration, MCHC): mCHC是指平均每L红细胞液中所含血红蛋白浓度(g/L) MCHC=每升血中所含血红蛋白克数(g/L)/每升血中红细胞比积(L/L)=g/L 举例: 血红蛋白136g/L, 红细胞比积0.392L/L MCHC=136/0.392=347g/L 临床意义 正常人和各型贫血时, 红细胞平均参考值见表: ───────────────────────────────── 平均值 MCH(pg) MCV(fl) MCHC(g/l) 正常 27-31 82-92 320-360 大细胞性贫血 >正常 32-50 >正常 94-160 正常 正常细胞性贫血 正常 27-31 正常 82-92 正常 单纯细胞性贫血 <正常 21-24 <正常 72-80 正常 小细胞低色素性 <正常 12-29 <正常 50-80 <正常 240-360 贫血 ────────────────────────────────── 附注 1. 红细胞计数, 血红蛋白测定, 必须用同一抗凝血标本测定 2. 由于以上各项数字都是间接算出来的, 因此, 其前提是红细胞数, 血红蛋白, 比积 的测定数据必须是准确的, 否则, 误差很大. 3. 应结合红细胞形态学进行贫血分析. 红细胞沉降率测定 原理 红细胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate ESR)是指红细胞在一定条件下沉降的速度而言, 简称血沉. 在健康人血沉数值波动于一个较狭窄的范围内. 在许多病理情况下, 血沉可明显增快. 红细胞沉降是多种因素互相作用的结果. 其机理尚未完全阐明, 目前已知主要因素有血浆蛋白比例变化, 红细胞形态及数量等. 根据国际血液学标准化委员会(ICSH)推荐, 以魏氏法(westergren)为标准法 试剂: 109mmol/L拘橼酸钠液: 取二份结晶水的拘橼酸钠(分子量294.12)3.21g, 用蒸馏水溶解, 稀释 至100mL. 此液在室温保存不得超过二周. 操作: 1. 13×10mm试管一支, 在2mL容量处刻上记号, 加抗凝剂0.4mL. 2. 静脉采血后, 取下针头, 加血至刻度, 旋转混匀. 3. 用血沉管(300×2.5mm)吸取上述混匀血液至"0"刻度处, 拭去管外附着的　　血液, 将管直立在血沉架上. 4. 计时, 室温中静置1小时, 观察血浆高度, 以红细胞下沉的毫米数报告之. 参考值： 　　　　男 <15mm/60min 　　　　女 <20mm/60min 附注： 　1.红细胞在单位时间内下沉的速度, 与血浆蛋白的量与质, 血浆中脂类的量与质, 红细胞的大小多少, 是否成缗钱状相聚以及血沉管的内径, 清洁度,放置位置是否垂直, 室温高低都有关系. 2 要求： 1) 标本采集时应避免脂肪血 　　　 　2) 血液和抗凝剂比例要准确. 3) 血沉管内径要标准(2.5mm), 放置要垂直 4) 室温过高, 过低或贫血时, 对结果都有影响, 因此, 血沉管应 尽量放在18-25C室内测定. 临床意义: 增快 1 生理性 年幼小儿, 经期, 妊娠3个月至产后一个月 2 病理性 急性炎症 风湿热, 活动性结核, 风湿活动期, 组织严重破坏, 严重贫血, 恶性肿瘤, 重金属中毒等 网织红细胞计数 原理: 网织红细胞(reticulocyte)是介于晚幼红细胞和成熟红细胞之间的尚未完全成熟的红细胞. 因其胞浆内尚存留多少不等的嗜碱性物质RNA, 经煌焦油蓝新亚甲蓝等活体染色法染色, 嗜碱物质凝聚成颗粒, 其颗粒又连缀成线, 而构成网织状, 此种红细胞即网织红细胞. 试剂: 煌焦油蓝生理盐水溶液: 煌焦油蓝1g, 拘橼酸钠0.4g, 氯化钠0.85g, 溶于双蒸馏水100mL中, 过滤后备用 方法: 1 于小试管加一滴煌焦油蓝生理盐水溶液 2 加入末梢血2滴于上述试管中, 混匀 3 静置15-20分钟后, 取用一滴制成薄片 4 油镜下检查点1000个红细胞中网织红细胞数, 以百分率报告 参考值: 成人 0.005-0.015 新生儿 0.03-0.06 临床意义: 1 增加. 表示骨髓造血功能旺盛, 各型贫血均可增多, 溶血性贫血增加尤 为显著, 恶性贫血或缺铁性贫血应用维生素B12或供铁质后显著增多, 表示 有疗效 2 减少 .再生障碍性贫血 附注: 1 活体染色时间不能过短, 室温低时放37℃温箱 2 最好制片二张, 每张片计数500个红细胞, 避免分布不均引起的误差, 涂 片要薄而均匀, 不使红细胞重叠. 3 为计数方便, 可于目镜中放一中间有孔之硬纸片, 缩小视野便于计数 4 试剂应定期重配, 以免变质沉淀 5 用瑞-姬氏染色可使网织红细胞计数减少 6 网织红细胞绝对值计算 网织红细胞数/ul=网织红细胞%X红细胞数/ul/100 参考值: 2.4万-8.4万/ul(24-84×109/L) 点彩红细胞计数 原理: 点彩红细胞的性质未完全明了, 有人认为可能是发育过程中遭受损伤的尚未完全成熟的红细胞. 其胞浆中含有残存的已变性的RNA, 故用一般碱性染料染色, 就能显现出来. 试剂: 碱性亚甲基蓝染液 亚甲基蓝 0.5g 碳酸氢钠 3.0g 蒸馏水 100mL 溶解后过滤备用, 此液可保存2-3周,如有沉淀应重新配制 操作: 1 按常法制成薄片, 自然干燥后用甲醇固定3分钟. 2 用碱性亚甲基蓝液染色1-2分钟水洗待干 3 用油镜计数值1000个红细胞中嗜碱性点彩红细胞数, 以百分率报告 参考值: <0.03%(<300×106红细胞) 附注 用碱性亚甲基蓝液染色后, 红细胞呈浅蓝绿色, 嗜碱性点彩呈深蓝色, 也可用瑞氏染色, 嗜碱性点彩呈蓝黑色. 由于点彩红细胞分布不均, 必要时扩大计数红细胞数 临床意义:增高：铅、汞、银铋等金属中毒及硝基苯、苯胺等中毒时显著增高, 溶血性贫血、巨幼细胞性贫血、恶性贫血、恶性肿瘤等可增高 红细胞碱粒凝集实验 原理 : 红细胞经碱处理破裂后, 溢出血红蛋白成为影细胞, 如红细胞残存着RNA呈颗粒状凝集而沉于影细胞中, 再经美蓝染色后, 可清晰地见到蓝色颗粒, 其意义与点彩红细胞同, 为铅中毒的辅助诊断之一. 试剂 美蓝染液 先将100mL蒸馏水煮沸, 再取硼砂1g溶解在沸水中, 然后加美蓝2g, 混匀, 待完全溶解后过滤备用, 此液可保存二周. 操作 1 按常规法制备血膜, 在空气中干燥1-3小时, 用小滤纸条浸透甲醇, 然后将血膜的半边用甲醇滤纸条覆盖2分钟作对照, 另一半血膜不固定. 2 浸入美蓝染液缸中, 染料10分钟水洗待干. 3 选择适当区域, 用油镜计数未固定侧内20个视野中具有大小不等蓝色颗粒的影细胞(仅隐约可见其轮廓) 4 再于血膜固定侧计数5个视野中完整红细胞数. 计算: 碱性红细胞占有核比例=20个视野碱粒红细胞/5个视野内红细胞数×4 参考值: 0.004-0.008或0.4-0.8% 临床意义与点彩红细胞计数相同.