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量值溯源

临床实验室通过校准为其检测系统确定标准值。为保证检测结果的准确性和一致性，必须保证参考物设定值可溯源到可能的参考方法和/或可能的高一级参考物质，以使常规的检测系统对患者样本的检测，在计量单位一致的前提下，得到和参考系列相同的检测量值。

一、量值溯源的概念

通过一条具有规定不确定度的不间断的比较链，使测定结果或标准值能够与规定的参考标准（通常是国家标准或国际标准）联系起来的特性，称为量值的溯源性（traceability）。溯源顺序通常采用溯源等级图来描述。要求校正常规方法的参考物必须溯源到国家或国际规定的参考方法上，最好是溯源到SI（国际单位制），SI单位表示了该物质量值的准确性达到计量基准，它具有非常小的不确定度。

除了保证参考物的溯源性外，临床实验室和生产厂商必须对检测系统各组分（仪器、试剂、参考物、和操作程序）实行严格的标准化程序，才能实现患者检验结果的溯源性。

二、量值溯源的意义

临床医生通常将实验室检验结果与参考区间和医学决定水平进行比较，结合患者其它医学信息做出临床判断。但如果实验室间的检验结果一致性不好，使参考区间和医学决定水平有差异，将混淆临床医生的医学判断，并可能导致错误的医学决策。特别对于由科学家或专业协会建议和提倡运用共同判断标准对治疗进行干预，例如在高胆固醇血症和糖尿病的治疗指南中，提出根据检验结果的临床诊断值、干预值和目标值等。实验室间的检验结果一致性不好，可能导致对检验结果的错误解释和对疾病的错误干预。因此，有必要开展量值溯源和检测系统的标准化，以实现各实验室测定结果的一致性或不同医院的实验室检验结果的互认性，也即改进试验结果在空间和时间上的可比性。

三、参考物的量值溯源

在临床实验室的定量分析中，通过不同级别的测量程序、参考物和校正物，

实现连续测量。用一个测量程序为某种物质定值，该物质用作下一级测量程序的校正物。依此类推，形成了一条不间断的比较链，也称溯源链。

（一）参考物量值溯源的意义

使用公认的参考方法来标化测定参考物，通过严密的测定程序，所得到的参考物的测定值是可靠的，该参考物的量值可溯源到上级参考方法和/或参考物质。在常规临床实验室，用该参考物去校准常规的检测系统。经过一系列的检测过程，得到患者样本的分析物含量。该样本的分析物含量接近使用参参考方法测定所获得的结果。因此，通过溯源的参考物校准常规方法，测定患者样本所得结果的准确性可源溯到参考方法。常因为参考物是处理过的样本，它和新鲜患者样本的基质有差异，使参考方法的准确度不能完全通过参考物传递给患者样本，所以对参考物的量值可能有一定的调整。

常规测定方法中量值溯源参考物使用的目的是，被测定物的测定结果要求接近通过参参考方法所获得的结果。因此，通过溯源的参考物来校准常规测定方法得到的结果的真实性就可追溯到参考方法。

（二）参考物的量值溯源程序

1．溯源链和校准层次 根据溯源的定义，一条连续的、可溯源的、分层次的比较链，每条链有已知的测定不确定度，使参考物的值或患者样本测定结果可溯源到国家或国际规定的参考方法，如图3-3所示。

材料 校准

方法 定值

SI-单位

一级参考测定方法

二级参考测定方法

厂家选择的测定方法

厂家的工作测定方法

终端用户的 常规测定方法

一级参考物

二级参考物

厂家工作校准品

厂家生产的校准品

常规样本

测定结果

溯 源

不 确 定 度

图3-3参考物的量值溯源等级图

图3-3描述了多层次多水平相互交错的测定方法和校准物质，箭头方向表示相互的关系。在每一级水平，图左边的参考物用作校准右边的测定方法，后者可为下一级参考物定值。SI单位溯源链开始于被测物顶端（检测系统、分析物、测定值的种类），遵循SI单位的溯源路径（通过一级参考测定方法和一级参考物），溯源链结束于测定患者样本的终端用户常规测定方法。溯源链自上而下各环节的溯源性逐渐降低，而不确定度则逐渐增加。

国际计量局、国家计量局、被认可的参考实验室可为二级参考物定值；厂家为终端用户提供常规测定方法的溯源文件。

2．参考物传递方案

（1）SI单位溯源链：理想的溯源链终点是SI，传递如图3-3。但一些分析物无公认的参考物质或参考方法，就不能提供其溯源路径。例如，镁在血浆中以与蛋白结合、离子形式和复合物形式存在，镁的测定表达为总的离子浓度形式和复合物形式。由于有不同的量值，其参考物需要追踪各自的溯源路径，某些溯源路径不能提供或从技术方面还得不到某些分析物的超纯物质（一级参考物），使得不能实现溯源。因此，在生物样本中，根据其病理生理特点，用SI单位表示的分析物实际上是一个种类或一组物质而不是单一物质。如某分析物在血清中，可能以完整的形式、降解产物或复合物形式存在；也可能因不同的异构体或糖基化的不同而具有不均匀性。另外，对于SI单位标识的分析物，用不同的测定方法测定（主要是免疫方法），因使用的抗体所作用抗原表位的不同，可能显示不同的分析特性。如人绒毛膜促性腺激素（HCG）以不同的分子形式存在于血清中，一些形式表达在妇女的妊娠期间，另一些形式表达在某些肿瘤疾病中。因此，测定不同的表达形式，用于不同的诊断目的。

（2）其它参考物溯源方案：对没有SI单位的分析物，可溯源到“国际惯例”表示的参考物质和参考测定方法。国际惯例的参考物质和参考测定方法不等同于SI单位溯源链中的一级参考物和一级参考方法，是国际惯例使用的替代品和替代方法。对于不能溯源到SI单位的物质的溯源问题分四种情况，如图3-4、3-5、3-6、3-7所示。图3-4-a表示有参考测量程序和参考物的分析项目的溯源，如皮质醇激素（图3-4-b）、HbA1c、某些酶活性。由IFCC工作组/分委员会提供参考测量程序（RMP）和参考物（RM）；图3-5表示有参考测量程序而没有参考物的分析项目的溯源，该类项目以凝血因子的测定为多。凝血因子具有一定的生物学活性，常采用以“正常血浆”作为参考物的凝固试验（生物学效应）。该试验被WHO承认，这类项目大约有30项；图3-6表示有参考物而无参考测量程序的分析项目的溯源，这类项目大约有300项, 如血浆蛋白类；图3-7表示既无参考测量程序（RMP）又无参考物（RM）的分析项目的溯源, 如肿瘤标志物、某些酶类，可溯源到厂家设定的参考方法。表3-2列举了一些临床常规检测项目的上级参考方法或参考物。常规实验室了解各溯源方式，为获得其分析测定项目的溯源依据提供路径。

图3-4-a具有参考测量程序和参考物的量值溯源等级图

图3-5具有参考测量程序而没有参考物的量值溯源等级图

表3-2 常规检测项目的溯源性示例

	常规项目（常规方法）		参考方法或参考物
	酸性磷酸酶（萘酚磷酸）		厂家指定的参考方法
	前列腺酸性磷酸酶（萘酚磷酸）		厂家指定的参考方法
	白蛋白（plus）		CRM 470
	白蛋白（BCG）		CRM 470
	a-1-抗胰蛋白酶（免疫透射比浊）		CRM 470
	碱性磷酸酶（IFCC）		IFCC催化活性浓度测定的参考方法
	ALT/ALAT（IFCC有/无PYP）		IFCC催化活性浓度测定的参考方法
	总淀粉酶（IFCC）		IFCC催化活性浓度测定的参考方法
	载脂蛋白A-1（免疫透射比浊）		WHO国际参考品SP1-01
	载脂蛋白B（免疫透射比浊）		WHO国际参考品SP3-07
	AST/ASAT（IFCC有/无PYP）		IFCC催化活性浓度测定的参考方法
	碳酸氢盐		新标准（纯物质称量）
	总胆红素（DPD）		acc.to Doumas
	总胆红素（J-G法，M-E法）		acc. to Doumas
	直接胆红素（J-G法，M-E法）		厂家指定的参考方法
	C3-c补体（免疫透射比浊）		CRM 470
	C4补体（免疫透射比浊）		CRM 470
	钙（邻甲酚酞络合酮，O-CPC）		原子吸收
	氯（ISE）		电量滴定
	胆固醇（CHOP-PAP）		a) ID-MS法 b) Abell-Kendall法
	胆碱酯酶（丁基硫代胆碱）		厂家指定的参考方法
	铜蓝蛋白（免疫透射比浊）		CRM 470
	肌酸激酶/CK（IFCC，DGKC）		IFCC催化活性浓度测定的参考方法
	肌酸激酶MB/CK-MB（IFCC改良）		IFCC催化活性浓度测定的参考方法
	肌酐（酶比色法plus）		ID-MS
	肌酐（Jaffe）		ID-MS
	CRP C反应蛋白（免疫透射比浊）		CRM 470
	CRP C反应蛋白 （颗粒增强，免疫透射比浊）		CRM 470
	果糖胺（NBT）		厂家指定的参考方法
	GGT（IFCC）		IFCC 催化活性浓度测定的参考方法
	GLDH（DGKC 1972）		厂家指定的参考方法
	葡萄糖（GOD-PAP,HK）		ID-MS
	HBDH（DGKC 1972）		厂家指定的参考方法
	HDL-胆固醇		CDC〔用葡聚糖硫酸盐沉淀和Abell Kendall 〕
	结合珠蛋白（免疫透射比浊）		CRM 470
	Kappa（免疫透射比浊）		CRM 470（通过IgG、IgA、IgM）
	免疫球蛋白G（免疫透射比浊）		CRM 470
	免疫球蛋白A（免疫透射比浊）		CRM 470
	免疫球蛋白M（免疫透射比浊）		CRM 470
	铁（ferrozine）		一级参考物（纯物质称量）
	乳酸（酶比色法）		一级参考物（纯物质称量）
	Lambda（免疫透射比浊）		CRM 470（通过IgG、IgA、IgM）
	LDH L-P（IFCC）		IFCC催化活性浓度测定的参考方法
	LDL-胆固醇		CDC〔用肝素/镁（超离心）和Abell-Kendall〕
	脂肪酶（比色法）		厂家指定的参考方法
	镁（xylidylblue）		原子吸收
	前白蛋白（免疫透射比浊）		CRM 470
	无机磷（磷钼酸 UV）		一级参考物（NERL） （纯物质称量）
	钾（ISE）		火焰光度法
	总蛋白（双缩脲）		SRM 927c
	水杨酸（比色法）		一级参考物（纯物质称量）
	钠（ISE）		火焰光度法
转铁蛋白（免疫透射比浊）		CRM 470
甘油三酯（GPO-PAP）		ID-MS, 以一级参考物校准
甘油三酯（去除甘油空白）		SRM 909b
尿素/BUN（脲酶 UV）		SRM 909b
尿酸（酶比色法plus）		ID-MS

注：

1．CRM (certified reference material)＝欧洲共同体认可的参考物，

2．SRM (standard reference material)＝ 美国标准参考物

3．ID-MS(isotope-dilution mass spectrometry) ＝ 同位素稀释－质谱分析

4．CDC(Centers for disease control) = 美国疾病控制中心

3．测量不确定度的表达 测量不确定度是量值溯源过程中不可避免的，被测物的不确定度贯穿整个量值溯源链，开始于一级参考物提供者，延伸到体外诊断试剂生产厂家，以及为参考物定值的过程。

4．校准溯源的验证 校准溯源验证的目的是确定终端用户获得的结果与贯穿于量值溯源链的参考测定方法和/或参考物质的一致性。验证过程有三个要素：①由体外诊断试剂生产厂家测定的值应与用参考方法测定的数值相同；②由体外诊断试剂生产厂家用参考方法测定结果在数学上相等的评估，即线性回归方程斜率=1、截距为零；③要求厂家参考物测定结果有互通性。

5．量值溯源的长期评估 为确保在任何时候量值可溯源，要求有一套系统程序来评估参考物的后期性能和进行必要的纠正，室间质量评价（external quality assessment, EQA）是最易实现的量值溯源的长期评估方法。

四、测量不确定度

二、方法学评价的基本步骤

1．确定某方法的质量目标，即可允许误差，常用允许总误差（allowable tatal error， TEa）来表示。

2．选定及进行适当的揭示分析误差类型的实验，如批内和日内重复性试验、

日间重复性试验、回收试验、干扰试验、方法比较试验等。

3．收集试验数据，进行统计学分析，以评估分析误差的大小。

4．将测定的误差与选定的可允许误差进行比较，判断方法的可接受性。

三、误差的分类和表示

根据误差的性质，可将其分为系统误差和随机误差两类。

1．系统误差

（1）定义：系统误差（systematic error，SE）是指测定值与真值存在的同一倾向的偏差。系统误差或正或负，即具有单向性，一般由恒定的因素引起，并在一定条件下多次测定中重复出现。

（2）分类：系统误差可分为恒定系统误差（constant error，CE）和比例系统误差（proportional error，PE）。恒定系统误差指测定值与真值之间存在恒定的误差，其大小与干扰物浓度相关，而与被测物浓度无关。比例系统误差则与被测物浓度成正比。恒定系统误差和比例系统误差可通过试验测定得到。

（3）来源：系统误差的来源主要有：①方法误差，由方法分析性能固有的缺陷所致，如方法特异度低、抗干扰能力差。可通过改进方法或淘汰旧方法，建立新的有高特异度的方法来减小方法误差；②仪器误差，由仪器的技术性能不佳所产生的误差，常见于仪器波长不准、重量或体积量器不准、温度或pH测量不准等引起。通过波长校准、计量器械的定期鉴定、仪器技术性能的认真考核等措施，可有效减小仪器误差；③试剂质量差、试验用水不合格、参考物不纯也会带来系统误差；④由于操作不规范，如反应的保温时间不足、加样不准等可引起操作误差。

2．随机误差

（1）定义：随机误差（random error，RE）是指多次重复测定某一物质时出现的误差，误差无一定的大小和方向，数据呈正态分布。

（2）来源：随机误差反映了分析方法的不精密度，由不可避免和难以预测的测定仪器、试剂、环境等实验条件的改变以及分析人员操作习惯等因素的变化而引起。严格按照标准化的操作规程进行试验及严格控制试验条件可减少随机误差。

随机误差和系统误差是相对的，随机误差和系统误差在一定条件下能相互转化。如图3-8可直观地表示出恒定系统误差、比例系统误差和随机误差。

1.基本步骤 用试验方法和比较方法同时测定一组患者的样本，分析二者测定结果的差异，可得到恒定或比例系统误差的信息。

2.试验要点

（1）比较方法的选择：方法比较试验是用两种方法同时测定一批样本，计算出两方法间测定结果的差异，以此来估计试验方法在测定样本时可能引入的误差。当选择已知准确度的常规方法作为比较方法时，部分误差来自于比较方法，其它部分误差则来自于试验方法；若选择准确度高的参考方法作为比较方法，可把方法间的任何分析误差都归于试验方法。

（2）试验样本：最好选择常规应用的检测对象作为试验样本，如患者血清

样本、尿液样本。样本数量至少40例，其浓度要尽可能覆盖整个“可报告范围”，即常规检验中可能遇到的整个分析范围。样本的质量比样本数量更为重要，即选择的样本浓度范围广比样本数量多对于方法之间系统误差的分析更有价值。增加样本数量可克服个别样本基质效应的差异对结果解释的影响，增大样本量（如100 ~ 200个）还可观察到试验方法与比较方法特异度的差异。

（3）样本测定：最好每个样本在不同的分析批测定2次，这样比单次测定更有助于发现样本错误，决定是否剔除某些极端值。如单次测定，要特别注意测定数据无差错，对两方法测定结果差异大的样本要重新分析。通常每一份样本在2小时内由试验和比较方法完成测定；若样本稳定性差，完成测定时间应该缩短。必须避免由于样本处理不当引起测定结果间的差异。

（4）实验间隔：每天8个样本在不同的分析批测定，连续测定5天；也可增加实验间隔为20天，每天测定2~ 3个样本。在不同的时间、不同的批次测定可减少单批测定所引起的系统误差。

3.结果分析

（1）作图分析：作图法是方法学比较最基本的分析技术，可以直观地初步判断数据的分布特点。对于两方法测定结果差异大的样本要重新测定，以确认样本的正确性，有两种图示法帮助结果分析。

1）差异分析：若希望两方法结果相对一致，可采用此图示法。横坐标（X）

为比较方法的结果，纵坐标（Y）为两方法之间的差异，如图3-9。理想情况是数据围绕中线（0线）上下均匀分布，若低浓度数据分布在中线之上，而高浓度数据分布在中线之下，提示有恒定或系统误差存在。

2）对比分析：对于两方法结果可能不完全相对一致的，如不同条件的酶法分析，可采用此图示法。横坐标（X）为比较方法的结果，纵坐标（Y）为试验方法的结果，如图3-10。

（2）统计分析：统计分析可提供两种方法间系统误差的大小及系统误差类型的客观数据。常用的统计分析包括相关回归分析和配对t检验等。

1）相关回归分析: 对于分析浓度范围较宽的项目（如血糖、胆固醇等）

的比对研究可作相关回归分析。该统计分析可在多个医学决定水平判断方法是否可接受，以及判断系统误差的类型，以帮助寻找误差的来源。

表3-4 临床化学分析推荐的允许误差（CLIA 88）

项目	医学决定水平Xc	总分析误差目标 CLIA		精密度的目标要求 （Xc×CLIA/4）
丙氨酸氨基转移酶	50U/L	±20%		2.5 U/ L
白蛋白	35g/L	±10%		0.9 g/L
碱性磷酸酶	100U/L	±30%		7.5 U/L
	150U/L	±30%		11 U/L
门冬氨酸氨基转移酶	30U/L	±20%		1.5 U/L
胆红素	17.1umol/L	±6.8umol/L		1.71 umol/L
	342umol/L	±20%		17.1 umol/L
总钙	1.75mmol/L	±0.25mmol/L		0.0625 mmol/L
	2.7mmol/L	±0.25mmol/L		0.0625 mmol/L
	3.25mmol/L	±0.25mmol/L		0.0625 mmol/L
氯	90mmol/L	±5%		1.125 mmol/L
	110mmol/L	±5%		1.375 mmol/L
胆固醇	5.2mmol/L	±10%		1.3 mmol/L
高密度脂蛋白胆固醇	0.91mmol/L	±30%		0.06825 mmol/L
	1.69mmol/L	±30%		0.12675
皮质醇	50ug/L	±25%		3.125 ug/L
肌酸激酶	200U/L	±30%		15 U/L
肌酐	88.4umol/L	±15%		7.072 umol/L
	265.2umol/L	±15%		9.724 umol/L
葡萄糖	2.8mmol/L	±0.336 umol/		0.084 umol/
	7.0mmol/L	±10%		0.1764 mmol/L
	11.2mmol/L	±10%		0.28 mmol/L
铁	26.85umol/L	±20%		1.3425 umol/L
乳酸脱氢酶	300U/L	±20%		15 U/L
钾	3mmol/L	±0.5 mmol/L		0.13 mmol/L
	6mmol/L	±0.5 mmol/L		0.13 mmol/L
总蛋白	70g/L	±10%		1.75 g/L
钠	130mmol/L	±4 mmol/L		1 mmol/L
	150mmol/L	±4 mmol/L		1 mmol/L
甘油三脂	1.76mmol/L	±25%		0.11 mmol/L
尿素	9.639mmol/L	±9%		0.217 mmol/L
尿酸	357umol/L	±17%		15.17 umol/L
镁	0.646 mmol/L	±25%		0.04 mmol/L
淀粉酶	100U/L	±30%		7.5 U/L
pH	7.35	±0.04		0.01
	7.45	±0.04		0.01
PCO2	35mmHg	±5 mmHg或 ±8%		1.3mmHg
	50 mmHg	±5 mmHg或 ±8%		1.3 mmHg
PO2	30 mmHg	±3SD		0.75 SD
	80 mmHg	±3SD		0.75 SD
	190 mmHg	±3SD		0.75 SD

表3-4 临床化学分析推荐的允许误差（CLIA 88）

项目	医学决定水平Xc	总分析误差目标 CLIA		精密度的目标要求 （Xc×CLIA/4）
丙氨酸氨基转移酶	50U/L	±20%		2.5 U/ L
白蛋白	35g/L	±10%		0.9 g/L
碱性磷酸酶	100U/L	±30%		7.5 U/L
	150U/L	±30%		11 U/L
门冬氨酸氨基转移酶	30U/L	±20%		1.5 U/L
胆红素	17.1umol/L	±6.8umol/L		1.71 umol/L
	342umol/L	±20%		17.1 umol/L
总钙	1.75mmol/L	±0.25mmol/L		0.0625 mmol/L
	2.7mmol/L	±0.25mmol/L		0.0625 mmol/L
	3.25mmol/L	±0.25mmol/L		0.0625 mmol/L
氯	90mmol/L	±5%		1.125 mmol/L
	110mmol/L	±5%		1.375 mmol/L
胆固醇	5.2mmol/L	±10%		1.3 mmol/L
高密度脂蛋白胆固醇	0.91mmol/L	±30%		0.06825 mmol/L
	1.69mmol/L	±30%		0.12675
皮质醇	50ug/L	±25%		3.125 ug/L
肌酸激酶	200U/L	±30%		15 U/L
肌酐	88.4umol/L	±15%		7.072 umol/L
	265.2umol/L	±15%		9.724 umol/L
葡萄糖	2.8mmol/L	±0.336 umol/		0.084 umol/
	7.0mmol/L	±10%		0.1764 mmol/L
	11.2mmol/L	±10%		0.28 mmol/L
铁	26.85umol/L	±20%		1.3425 umol/L
乳酸脱氢酶	300U/L	±20%		15 U/L
钾	3mmol/L	±0.5 mmol/L		0.13 mmol/L
	6mmol/L	±0.5 mmol/L		0.13 mmol/L
总蛋白	70g/L	±10%		1.75 g/L
钠	130mmol/L	±4 mmol/L		1 mmol/L
	150mmol/L	±4 mmol/L		1 mmol/L
甘油三脂	1.76mmol/L	±25%		0.11 mmol/L
尿素	9.639mmol/L	±9%		0.217 mmol/L
尿酸	357umol/L	±17%		15.17 umol/L
镁	0.646 mmol/L	±25%		0.04 mmol/L
淀粉酶	100U/L	±30%		7.5 U/L
pH	7.35	±0.04		0.01
	7.45	±0.04		0.01
PCO2	35mmHg	±5 mmHg或 ±8%		1.3mmHg
	50 mmHg	±5 mmHg或 ±8%		1.3 mmHg
PO2	30 mmHg	±3SD		0.75 SD
	80 mmHg	±3SD		0.75 SD
	190 mmHg	±3SD		0.75 SD

（二）回收试验

回收试验用于评估试验方法准确测定加入纯分析物的能力，结果用回收率表示。该试验可以检测试验方法的比例系统误差，并可有助于校正物的定值。

（1）加标体积：加入的标准液体积要尽可能少，使回收样本的基质成份与原始样本接近，一般加标体积在总体积的10%以内。

（2）吸量准确：因加入分析物的浓度值是根据加入标准液体积及原样本的体积计算而得，吸量是否准确直接影响回收结果的准确性，应选择经校正的吸样器并按规范要求操作吸量。

（3）加入待测物的浓度：在保证总浓度在方法分析测量范围内，最好使加标后的样本中被测物浓度达到医学决定水平。如：正常血糖浓度在3.9 ~ 6.2mmol/L, 如果加入2.8 mmol/L 葡萄糖，可使回收样本浓度达6.7 ~ 9.0 mmol/L，此范围正是解释血糖结果的关键水平。

（4）标准液浓度：因加标体积占总体积的10%以内，即标准液将被稀释约10倍，配制的标准液浓度应为回收浓度的10倍。例如患者样本葡萄糖浓度为3.5mmol/L，加入适量标准液后使其达到7.0mmol/L，欲使0.9ml患者样本加入0.1ml标准液后增加3.5mmol/L，应配35mmol/L的标准液。

（5）重复测定：为了减少随机误差的干扰，每一个样本通常重复测定2 ~ 3次；一般须作高、中、低不同浓度的回收试验，分别计算各浓度的平均回收率。

（6）计算比例系统误差：比例系统误差 = 100% - 平均回收率

3.可接受性判断 将比例系统误差的大小与CLIA规定的TEa标准（同表3-4）进行比较，若小于TEa即可接受。

4.范例 某法测定血清钙回收率：

（1）样本制备：① 基础样本：血清1ml+蒸馏水0.1 ml。

② 回收样本1：血清1ml+5.0 mmol/L钙标准液0.1ml。

回收样本2：血清1ml+10.0 mmol/L钙标准液0.1ml。

（2）按表3-5填入结果：

表3-5 回收试验检测结果

测定浓度（mmol/L） 加入浓度（mmol/L）回收浓度mmol/L 回收率（%）
基础样本	2.45	—	—	—
分析样本1	2.87	0.45	0.42	93.3
分析样本2	3.32	0.91	0.87	95.6

（三）干扰试验

干扰试验是通过定量检测样本中的物质所引起试验方法的系统误差，以评价方法的准确度。由干扰物质引起的误差通常是恒定系统误差，与分析物的浓度无关系。

1.基本步骤 见流程图3-12

2.试验要点

（1）试验样本：标准溶液或患者样本均可作为干扰试验的样本，由于患者样本来源方便、基质成份同实际样本，常选择患者样本作为试验样本。

（2）加入干扰物的体积：加入干扰物的体积要尽可能小，以减少稀释。

（3）吸量精确：吸量的精密度要尽可能高，以保证干扰样本和基础样本的体积一致。

（4）干扰物的浓度：加入干扰物的浓度须达到有价值的水平，尽可能达到病理样本的最高浓度值。如：氧化酶法测定血糖受到维生素C的干扰，血液中0.85mmol/L的维生素C是其最高浓度值，因此，加入维生素C的浓度应为0.85mmol/L。在确定某物质对分析方法有干扰后，进一步测定在何种水平上产生的误差在临床上无意义，即确定不影响临床应用价值的最低可疑物浓度值。

（5）可疑干扰物的选择：可根据方法的反应原理、干扰物数据库、厂家建议和文献提示选择可能的干扰物。一般考虑的干扰因素包括胆红素、溶血、脂血、防腐剂、抗凝剂、某些药物和食物成分等。加入胆红素标准制备胆红素血、机械溶血制备溶血样本、加入脂肪标准制备脂血样本或对高脂样本超速离心前后对比等进行干扰试验。

（6）重复次数：每个样本通常重复测定2 ~ 3次。

（7）计算干扰值：干扰值= 干扰样本测得值 - 基础样本测得值

3.可接受性判断 将干扰引起系统误差的大小与CLIA规定的PT TEa（同表4-1）进行比较，若小于TEa即可接受。如：0.85mmol/L 维生素C对氧化酶法测定血糖的平均干扰值为0.7 mmol/L，CLIA规定的血糖PT的TEa为10%，若血糖上限为6.1 mmol/L，则可允许0.6 mmol/L的误差。因此，维生素C对氧化酶法测定血糖所产生的干扰不可接受。

（四）小结

1．方法比较试验 用以评价试验方法的恒定和比例系统误差。

（1）选择40例患者样本，其浓度覆盖整个分析范围；

（2）每天在2小时内用试验和比较方法测定8份样本，连续测定5天；

（3）作图初步分析；

（4）重新测定结果差异大的样本；

（5）收集数据，进行相关回归分析，如r ≥ 0.99，可根据回归方程估计

在医学决定水平的系统误差或随机误差；如r < 0.99，通过t检验估计两方法在平均水平的偏差；

（6）结合系统和随机误差，通过与TEa比较，或使用方法决定图，作出总误差的可接受性判断。

2．回收试验和干扰试验 回收试验用以评价方法的比例系统误差，干扰试验用以评价方法的恒定系统误差。回收和干扰试验可作为比较试验的替代方法，以评价试验方法的系统误差。

（1）回收和干扰试验的技术方法相同，均是在基础样本中加入一定量的标准物，但所加入的物质不同：回收试验中加入的是待测物标准，干扰试验中加入的是可疑干扰物。

（2）数据处理不同 计算配对样本测定结果之差得到干扰值，即恒定系统误差；计算平均回收率得到比例系统误差。

（3）与TEa比较，做出误差的可接受性判断。

（五）A Deeper Look

1．实验室不仅要对新建方法进行评价，还应对新使用的方法（即使厂家已提供了性能指标）或分析条件发生了变化（如：更换了试剂、仪器进行了大修、操作规程改变等）的方法进行性能评估，以确认性能满足要求。

2．按照美国临床实验室修正案（clinical laboratory improvement amendment, CLIA）要求，某些性能指标在评价之后，每年还要验证两次，如：线性范围、方法性能比较等。

3．根据试验方法的复杂程度按照一定的程序进行方法性能评价。试验方法的分类和标准化的评价程序可参考CLIA的规则和临床实验室标准化研究所（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）的有关文件。

（一）重复性试验

重复性试验（replication experiment）的方法是将同一材料分成数份试验

样本，进行多次分析测定（一般为20次），其目的在于评价或验证试验方法的随机误差或不精密度。用于描述与时间相关的不精密度的试验包括批内重复性试验、日内重复性试验和日间重复性试验等。

1. 基本方法

2. 试验要点

（1）试验样本的选择：标准液、控制物溶液、患者样本或混合血清均可用

于精密度评价，视其用途而定。①标准液简便易得，可制成不同浓度，干扰因素少，可作为评价随机误差的最佳样品；②冻干质控物稳定、使用方便，适用于进行日间重复性试验。但应注意质控血清与患者血清不一样，加入的稳定剂、防腐剂可能干扰某些成份的测定，反复冻融亦会对试验结果有影响；③患者样本或混合血清常用于短时间内完成的试验，如批内和日内的重复性试验，使用时应详细记录样本的特性，如混浊、溶血、药物等。

（2）分析物浓度的选择：进行重复性试验的被测物浓度宜选择在医学上具有决定性意义的浓度水平，通常选择低、中、高三个水平的试验样本。

（3）试验样本数量：在试验周期内至少作20个样本的检测。增加样本量有利于更好的评价随机误差，但是同时会增加成本和试验时间。最佳方案是在成本和试验周期允许的范围内尽可能多的增加样本量。

（4）试验条件：要尽量在相同的条件下，包括测量程序、人员、仪器、环境等，以及在测量条件保持不变的时间段内完成。

根据以上公式，可分别得到批内、日内和日间均数、标准差和变异系数。

4.性能可接受性判断 将计算得到的标准差与CLIA规定的TEa（同表3-4）进行比较，判断其不精密度是否可接受。

（1）短期试验的不精密度评价：批内或日内的标准差（s）应小于或等于CLIA规定的TEa的1/4，即：s_w-run or s_w-day ≤ 1/4 TEa。

（2）长期试验的不精密度评价：总的标准差（s_tot）应小于或等于CLIA规定的TEa的1/3，即：s_tot ≤ 1/3 TEa。

（3）方法决定图（method decision chart, MDC）：重复性试验得到的随机误差（RE）和准确度试验得到的系统误差（SE），构成了试验方法的总误差（TE），利用方法决定图可判断方法的性能。

5.方法决定图

（1）方法决定图的意义：方法性能最重要的是不精密度和不准确度，而方法应用者难以区别误差类别，更关心的是方法误差所造成的后果。此误差即总误差，包括了不精密度和不准确度，随机误差可由重复实验估计，得到方法的不精密度；系统误差可由方法比较实验所得到的试验方法和比较方法结果的均值间偏倚，或者由回归方程计算某特定医学决定水平处的偏倚估计，得到方法的不准确度。由此可计算得到总误差的大小，或应用Westgard的方法决定图（MD图），将不准确度（或偏倚）和不精密度在坐标图上表达，其结合点即总误差。将其与要求的质量作比较，从图上可判断方法性能。在决定图上，Westgard将方法性能分为四种：不符要求性能、临界性能、良好性能、优秀性能。

（2）方法决定图的制作：取坐标纸，按以下步骤作图：

1）确定分析质量要求，以TEa表示。将TEa表示为某决定水平浓度或靶值的百分数（%）。

2）在坐标纸上标记Y轴为允许不准确度（偏倚%），从0到TEa；X轴为允许不精密度（%，即CV），从0到0.5 TEa。

3）从Y轴的TEa到X轴的0.5 TEa画一条直线（0，TEa；0.5 TEa_，0），该线为偏倚+2S线；从Y的TEa到X的0.33 TEa画一条直线（0，TEa；0.33 TEa_，0），该线为偏倚+3S线；从Y的TEa到X的0.25 TEa画一条直线（0，TEa；0.25 TEa_，0），该线为偏倚+4S线。这几条线分别划分出了四个性能区域，即性能差（poor performance）、临界(marginal performance)、良好(good performance)和优秀(excellence performance)。TEa以10%为例，如图3-13所示。

4）评价试验所得到的不准确度（或偏倚）和不精密度的交点在坐标图上的位置即是该方法性能。

图3-13 方法性能决定图

（3）方法决定图的解释：使用MD 图时，将方法的误差表示为决定水平浓度或靶值的百分值。在X轴上点出不精密度的估计值（从批内和天间试验得到），在Y轴上点出不准确度的估计值（从方法学比较试验得到）。

1）从数学函数关系分析，通过偏倚TEa – 不精密度0.5TEa（+2s）线是确定方法性能的最低限。①如果试验方法的性能点在该线的上方，说明方法的总误差水平超过了TEa要求，方法性能不可接受；②如果试验方法性能点在该线上，表示方法的总误差等于TEa水平，方法性能处于临界水平的起点；

2）通过偏倚TEa – 不精密度0.33TEa（+3s）线是区分方法性能属临界还是良好的界线。①方法性能点处于偏倚+2s线和偏倚+3s线的区域（包括在偏倚+3s线上的），说明方法的总误差小于偏倚+2s，但仍然大于或等于偏倚+3s水平，这样的方法性能属于临界水平，方法在实际应用时对质量控制要求很高；②方法性能点处于偏倚+3s和偏倚+4s线的区域（包括在偏倚+4s线上的），说明方法的总误差小于偏倚+3s水平，但仍然大于或等于偏倚+4s水平，这样的方法性能属良好，该方法可在一定程度容忍实际使用中不稳定引起的误差；③方法性能点处在偏倚+4s线以下，说明方法的总误差小于偏倚+4s水平，方法性能属优秀，这类方法在实际应用时很容易控制。

（4）应用示例

1)示例1：某测定白蛋白的方法，测定值35g/L处的CV为2.0%，偏倚为0%；CLIA的质量要求是10%； X取2.0%，Y为0.0%，即图中的“1”点，如图3-14所示。因此它在方法性能决定图上的性能点位置清楚说明方法的性能属于优秀，该试验方法在常规应用中很易控制。

2)示例2：某测定血糖的方法，测定值7.0mmol/L处的CV为2.0%，偏倚为2.0%；当葡萄糖含量超过5.6mmol/L的时候，CLIA的质量要求也是10%，因此可以使用同一个方法性能决定图。该方法的性能点X取2.0%，Y为2.0%，即图中的“2”点。性能点位于良好区，方法性能可接受。此方法在日常应用中对质量控制要求较高，如同时用4个控制物（N=4）的多规则控制方法，才能保证要求的质量。

3)示例3：某测定胆固醇的方法，测定值在5.17mmol/L处的CV为3.0%，偏倚为3.0%。取X为3.0%，Y为3.0%，在方法性能决定图上点出性能点“3”，性能点的位置在临界性能区。对于这类方法，如能保证分析各环节的规范化操作，采用更多的质控方案，质量可以符合要求。

4)示例4：某测定葡萄糖的方法，测定值在6.6mmol/L处的CV为4.0%，偏倚为3.0%。当葡萄糖含量超过5.6mmol/L的时候，CLIA的质量要求也是10%。取X为4.0%，Y为3.0%，此方法的性能点为图中的“4”点。性能点位于性能不符合要求区，此方法不能用于临床常规检验。

图3-14 方法性能决定图应用示例

（二）小结

1．精密度评价时，实际测定的是不精密度，反应测定结果随机误差的大小。

2．重复性试验是评价或验证试验方法随机误差的常用试验，其结果通过计算均数（ ）、标准差（s）和变异系数（CV）来表示。

3．重复性试验评价的随机误差（RE）和方法比较试验评价的系统误差（SE）构成试验方法的总误差（TE），它们对方法学评价的意义如图3-13。横坐标（X）为可接受的不精密度，用标准差（s）的百分数表示，纵坐标（Y）为可接受的不准确度，用偏差（ ）的百分数表示。

4．由评价试验得到的某浓度水平（常是医学决定水平）的不精密度和不准确度（偏差%），在MD图上找到方法性能点，可对方法作出性能差、临界性能、良好性能和优秀性能的判断。

（三）A Deeper Look

精密度要求较高的试验方案，需要对短期和长期试验的变量因素提供更详细的信息。可参考临床实验室标准化研究所（CLSI）推荐的标准进行方案设计，使用变量分析(ANOVA)统计工具进行评估。

六、检测限的评价

检测限（limit of detection）是指检测系统可检测出的最低分析物浓度，此浓度限值对于要求准确定量体液中的某些低浓度物质，如：毒物、肿瘤标志物等的检测特别重要。通过检测限试验（detection limit experiment）可确定某检测系统/方法的检测限，包括检测低限、生物监测限和功能敏感度。

（一）检测限试验

检测限试验（detection limit experiment）用于评价检测系统可检测出的

最低分析物浓度。

1．试验样本 一般制备两种不同类型的样本。

（1）空白样本：即不含有待分析物的样本，常使用系列参考物中的“零标准”作为空白，理想的空白样本应和所检测的患者样本具有相同的基质。

（2）检测限样本：在空白样本中加入一定量的分析物配制成检测限样本，使其浓度达预期或厂家推荐的检测限浓度，通常要在预期检测限浓度附近制备几份不同浓度的检测限样本。对于某些项目，可使用某疾病已治愈的患者样本，如：前列腺特异抗原（PSA）的检测限样本，可使用前列腺癌治疗后的患者血清。

2.测定次数 对于样本的重复检测次数并无具体的规定，一般测定10 ~ 20次。

3.试验时间 如果从空白样本的重复性了解检测低限，常常做批内重复性或短期试验；如果从检测限样本的重复性了解检测低限，推荐做较长时间的重复性试验来评价日间的检测性能，一般做10次或10天检测。

4.结果计算 有三种表示检测限的术语，即检测低限，生物监测限和功能灵敏度。

（1）检测低限(lower limit of detection, LLD)：检测限试验结果中，空白样本测定均值加2（或3）倍标准差（空白样本），即：

95%可能性： LLD = _空白 + 2s_空白

99.7%可能性： LLD = _空白 + 3s_空白

检测低限反映了方法对空白样本测定的不确定度。需注意，直接读出浓度的检测系统对低于零的检测将报告为零，其分布不是正态分布，因此计算的标准差不能如实表达检测低限的真实情况。如果检测响应以初始值表示，如：吸光度、荧光等，此时计算的标准差有效。所以应使用初始响应值来计算均值和标准差，然后再转换成浓度单位。如测定结果小于或等于检测低限，报告为“无某待测物检出”。

（2）生物检测限（biologic limit of detection, BLD）：检测低限加2（或3）倍标准差（检测限样本），即：

95%可能性： BLD = LLD + 2s_{检测限样本}

99.7%可能性： BLD = LLD + 3s_{检测限样本}

生物检测限更真实地反映实际检测限浓度水平样本测定的不确定度。

检测限试验及其结果计算如图3-16所示。

（3）功能灵敏度（functional sensitivity, FS）：重复测定变异系数为CV 20%的检测限样本浓度，即在预期检测限附近几份不同浓度的样本重复性试验测定结果中，变异系数为CV20%的检测限样本浓度为功能灵敏度，功能灵敏度反映了方法能可靠测定的最低浓度。

几种检测限定义的关系见图3-15，检测限试验及其结果计算见图3-16。

图3-16 检测限试验及其结果计算示意图

5.应用示例 评价某胆固醇的测定方法的检侧限：用该方法测定胆固醇系列标准，结果见表3-6，计算其检测低限（LLD）、生物监测限（BLD）和功能灵敏度（FS）。

表3-6 某胆固醇系列标准测定结果

标准浓度（mmol/l）	0	2	4	6	8
	-0.23	2.84	5.51	6.46	6.92
	0.12	2.26	5.07	5.14	6.29
	-0.40	1.25	3.15	3.78	8.67
	0.13	3.52	2.72	7.28	7.86
	0.05	1.95	3.67	6.20	5.24
	0.18	2.71	5.35	5.00	7.38
	-0.41	3.07	5.22	5.54	7.41
	0.20	2.47	4.46	6.44	6.06
	-0.32	1.95	2.55	6.71	7.53
	-0.08	1.94	3.61	7.17	10.11
	-0.41	1.93	3.79	4.92	8.70
	-0.39	2.45	3.21	4.40	6.37
	-0.32	2.38	3.42	6.11	7.54
	-0.37	1.37	4.73	7.51	9.30
	-0.17	1.58	4.07	6.38	8.10
	0.38	2.46	3.47	5.55	7.87
	-0.31	2.55	3.28	8.19	8.20
	-0.41	2.57	5.67	8.48	7.99
	0.10	2.27	4.99	5.45	9.38
	-0.30	1.57	4.42	7.61	8.22
	-0.15	2.25	4.12	6.22	7.76
SD	0.26	0.57	0.97	1.26	1.20
CV	-173.50	25.44	23.46	20.28	15.44

以下计算均以“99.7%可能性”为例

（1）在“0”标准品组计算检测低限（LLD），即：

LLD = _空白 + 3s_空白=3×0.26=0.78（mmol/L）

（2）在“2”标准品组计算生物检测限（BLD），即

BLD = LLD + 3s_{检测限样本}=0.78+3×0.57=2.49（mmol/L）

（3）功能灵敏度（FS）：从表3-6中可知， 6 mmol/L标准品组的重复检测变异系数CV为20.08%，最接近20%。此时，检测限样本浓度为6.22，因此，本法的功能灵敏度为6.22（mmol/L）。

（二）A Deeper Look

关于分析检测限的术语和评价试验目前尚无公认一致的标准，生产厂家试剂说明书中所指的检测限通常是最低检测限（LLD），但从临床应用的角度，更关注生物检测限（BLD）和功能灵敏度（FS）。临床实验室标准化研究所提供了的检测限评价方案CLSI EP17-P，该方案不仅介绍了定量分析检测限的评价步骤，也介绍了定性分析检测限的评价步骤。

七、可报告范围

可报告范围（reportable range ）指可以报告的所有结果范围，包含两种类型的范围，即分析测量范围（analytical measurement range，AMR）和临床可报告范围（clinical reportable range，CRR）。

1.分析测量范围（analytical measurement range， AMR）指对没有进行任何预处理（稀释，浓缩等）的样本，分析方法能够直接测定出的待测物的范围，也就是系统最终的输出值（活性或浓度）与被分析物的活性或浓度成线性比例的范围，它反映整个系统的输出特性。

2.临床可报告范围（clinical reportable range，CRR）是指对临床诊断、治疗有意义的待测物浓度范围。此范围如果超出了AMR，可将样本通过稀释、浓缩等预处理使待测物浓度处于分析测量范围内，最后结果乘以稀释倍数。

常用线性实验来评价试验方法的分析测量范围，也即线性范围。

（一）线性试验

线性试验（linearity experiment）是指用试验方法对一系列浓度样本进行分析，对检测结果进行直线回归，评价该分析方法能准确报告的最低、最高的浓度或活性范围。

1.基本步骤

（1）试验样本：常用的样本包括：①混合患者血清，该样本有理想的样本基质，对于可获得高值样本的测定，选择混合患者血清是最方便的；②在混合患者血清中加入一定量的待测物，即对于难以获得病理高值样本的测定，可通过在混合患者血清中加入一定量的待测物，以得到高浓度的线性试验样本，并有适当的样本基质；③经过特殊处理的混合人血清，处理方法如：透析、热处理、层析等，用于制备低分析物浓度的样本；④参考物、商品化控制物或PT（能力验证）材料，此类样本使用方便，但由于不是正常的生理样本，因基质效应，可能会与实际线性结果有偏移。

（2）样本数量：从低到高至少有4至5份样本。

（3）样本测定：全部试验在同一工作日内完成，分析序列应为随即排列，有显著携带污染时，应用空白样本隔开待测样本。每份样本测定3至4次，计算其平均值。

（4）结果分析：观察结果有无明显的数据错误，若有明显异常时，应判断是否为离群点。全部数据中的离群点如果有2点或以上，则应放弃全部数据或重新进行实验。

离群点的判断：对于特定浓度Y_i值的离群点进行检测时，需将其4个重复值从大到小排列（Y_i-1到Y_i-4），计算极差D = Y_i-1 - Y_i-4；若Y_i-1可能是离群点，计算：D₁ = （Y_i-1 - Y_i-2）/ D；若Y_i-4可能是离群点，计算：D₄ = （Y_i-3 - Y_i-4）/ D。D₁或D₄如果大于0.765（P取0.05）或0.889（P取0.01），则该点判为离群点。

以分析物浓度（已知）为X轴，测定均值为Y轴，绘制X-Y线性图，目测分析测量范围；计算X-Y的回归方程。

（5）线性评价：常用的线性评价方法有：目测法是线性评价最直观的方法，但因非客观，人为影响因素大；回归分析受离群点的影响很大；G检验（NCCLS EP6-P方案）是线性评价科学客观的方案，但该方案无法对临床可接受的非线性进行分析和评价；近年来由美国临床病理学家协会(college associate of pathologists, CAP)推荐的多项式线性评价方案，能够对可报告范围内的非线性进行能否接受的评估，因此在实际应用中更加有意义。

（6）多项式线性评价

1）数据拟合：用具有数据拟合功能的软件（如SPSS等），将各个项目的数据分别拟合为一次(a+bx)、二次(a+bx+cx²)和三次(a+bx+cx²+dx³)多项式，判断各项系数与0之间的差异是否具有统计学意义（P<0.05），从而决定各项目的最佳拟合多项式，用p(x)表示，d表示最适多项式的次数，可为1、2或3。

2）最适多项式的精密度可用σ表示，

x_i为样本编号

n=S·R

R

y_i表示该项目各浓度样本实验测定结果

p(x_i)表示该样本浓度在最佳拟合多项式中的预测值

若数据满足下列公式，判断是具有临床意义的精密度，可继续进行线性评价；否则数据精密度差，线性评价无意义。

②若ADL小于临界值，判定该非线性无临床意义，其非线性程度临床可接受；若ADL大于临界值，判定数据呈非线性，该非线性程度临床不可接受。

4）多项式线性评价结果：①线性1：数据拟合的最佳形式为直线，所有数据几乎均落在一条直线上，且数据的精密度较高。②线性2：数据拟合的最佳形式为非直线，但与直线的偏离小于具有临床意义的临界值，且数据的精密度较高，即表示数据的非线性不具有临床意义。③非线性：数据拟合的最佳形式非直线，且与直线的偏离大于临界值，尽管数据的精密度较高，但非线性程度超过了可接受范围，并可能有临床意义。④不精密：数据的精密度差，不能用于线性评价，即这种情况的线性无评价的价值。

（7）线性验证

1）线性验证方法：测定校正验证材料，确定现有的校正设定在分析测量范围内的信号与分析物浓度的线性关系是否正确和稳定。如果实验室测定值超过了可接受的范围，说明方法/分析系统的校正错误或发生了漂移，须查明原因，重新校正。

2）校正验证结果：①验证1：校正直线的斜率与1无统计差异，截距与0无统计差异，校正验证在可接受范围内，方法和/或仪器的校正有效。②验证2：各点校正验正值在可接受的范围内，但校正直线的斜率与1有统计差异，截距与0有统计差异，校正验证在可接受范围内，方法和/或仪器的校正有效。③差异1：校正直线的斜率与1无统计差异，截距与0无统计差异，有超过了可接受范围的校正验证测定值，方法和/或仪器的校正无效。该现象通常由随机误差造成。④差异2：校正直线的斜率与1有统计差异，载距与0有统计差异。有超过了可接受范围的校正验证测定值，方法和/或仪器的校正无效。该现象由系统误差造成。