AU系列生化仪的部分参数界面及名词解释 AU系列生化仪进入中国后，颠覆了以往国人对生化仪盘式进样的理解。AU自带轨道的设计显得高大上，而且速度一直是AU系列的看家法宝，让先期进入中国的贝克曼和日立毫无招架之力。不过，随着自动生化仪的普及，人们发现AU的速度并非优势，结果的不可靠性开始出现，质疑声不断。AU的搅拌系统和杯冲洗系统一直成为问题，污染和滴落甚至漫盘让操作者伤透了脑筋，还为此被加拿大药监局召回。当然还有它的半导体冰箱问题。 不过，任何机器都会出问题，也都要保养，保养不够就会遭到报应。现在的中国人恨不得回到石器时代，拿起来就用，用完不管。要求所有的机器都做到召之即来，来之能战，战之能胜。但就是没有保养，也不想维护，更不用说维修了，那是花钱的玩意儿，而前者则是费时费力的事情，也是不愿意做。 其实，严格的保养维护作业，成本并没有增加多少，时间也花费不多，却能得到稳定可信的结果。所有的生化仪结果问题，大多出在保养和对设备的理解上。而在设备的理解上，相关名词的理解最为重要，因为它直接引导你的操作，一旦理解错误，那么结果不好也就顺理成章了。 AU系列生化仪从速度上分为400、800、1600、2000速。从反应盘数量上分为单盘和双盘，也就是800速以下和以上的区别。单反应盘配套试剂针和样本针各一个，双反应盘则是双倍针配套。冲洗站都是一组，搅拌系统有两组和一组的区分，AU400/480和2700/5400是一组，AU640/680/5800是两组。800速以上的机型都是两组光度计，一个灯泡通过光纤分配使用。 以上是简单的机器上面板介绍，下图是AU系列反应曲线的示意图：  图1 AU系列生化仪反应曲线示意 上图可以看出，AU的读点间隔都是18秒，整个反应周期有28个点，也就是28*18=504秒=8.4分钟。R1+S+R2方式，只能双试剂。R1加入读点为P0，S加入读点为P1，R2加入读点为P11。R1至R2时间为11*18=198秒=3.3分钟，S 至R2时间为10*18=162秒=3分钟，R2至P27最后反应点时间为16*18=288秒=4.8分钟。 AU的反应时间是固定的，只有28个点，没有长程反应。搅拌一共进行三次，分别是R1、R1+S、R1+S+R2。 上图是两条曲线，下面那条是试剂空白，上面那条是样本曲线， 下面以AU680为例，解释一些AU系列的名词。 1 空白概念：AU的空白（Blank）的概念有杯空白，其实这是反应杯的检查，在Photocal里进行，也是水空白（Water Blank，WB）；实时水空白;试剂空白（ReagentBlank，RB）。 1.1杯空白（Water Blank，WB）：AU的杯空白并不是实时的，而是需要时测定，或者执行周保养时才测定。一般更换反应杯或者灯泡或者W2清洗后才执行。而杯空白的检查是用来判断反应杯是不是在使用状态，借此判断是否自动封闭超限的反应杯。 各型号AU生化仪都有Photocal光度计校准这个菜单或者选项，在这个界面下可以选择全部反应杯或指定反应杯号的检查：  图2 Photocal光度计校准界面 这是合格的光度计校准界面，全部反应杯都是黑色字体。 绿色CuvetteCheck Error表示杯检查错误，仪器认为是擦伤。判断依据是将一个反应杯分为前后两部分进行检测，前后部分吸光度值超过0.01Abs，则认为是有划痕擦伤。 红色Mean CheckError表示平均值检查，某一个杯子反应杯的吸光度值与所有反应杯吸光度平均值的差异不能大于0.03Abs，否则该杯将被红色标记，系统自动封闭该反应杯。 橙色Lamp CheckError是灯泡检查，这一项要经过两次比对，第一次是所有反应杯在所有波长下的吸光度值小于等于1.7Abs，第二次是将所有反应杯的光度计值与更换灯泡后的该反应杯光度计值做比较，两次的结果应该小于等于0.1Abs。这两次检查有任何一次超限就会被橙色标记。 要注意的是，仪器并不知道你什么时候换的灯泡，其实是跟上一次的Photocal值做的比较。这一点与AU老型号的机器蓝色标记类似，新型号去掉了蓝色标记，改用橙色标记。 偶尔几个反应杯出现颜色标记时，可把该反应杯取出，人工清洗擦干后再行测试。或者干脆更换。出现橙色或者蓝色，可先行保存，然后接着点击检查，也就是说上次的数据可能是很久之前的，保存一次把数据库的数据覆盖，然后再检查，这样两次的比较就应该很接近，蓝色或者橙色就会消失。但如果这么操作还是无法消除橙色，就要尝试更换反应杯或者灯泡了。 大面积的出现红色，应该首先检查冲洗站，漫盘的可能性最大。大面积出现绿色或者红绿兼而有之，首先检查灯泡和灯泡供电，光源不稳可能性最大。 在Photocal检查里进行的杯空白是利用去离子水作为介质的，并不是空反应杯进行测试。所以这里的杯空白又叫水空白（Water Blank）。但Photocal并非强制性，也不是每天必须的。而且是个多合一的数据，同时是用来判断反应杯是否能够使用的依据。这个水空白的数据在定标、结果计算里会经常用到。 后面用到的水空白校正公式是：ODF（X）=OD（X）-F（X） ODF（X）是水空白校正后的吸光度值； OD（X）是水空白校正前的吸光度值； F（X）是该反应杯的指定波长吸光度值； X是0-27个读点。 1.2 实时水空白：是冲洗站每次清洗完反应杯后测定的水空白数据，这是实时的，每次清洗后的水空白数据与上次的Photocal光电校准里的水空白数据进行比较，误差太大则自动封闭，暂时不使用。 注意：如果上次Photocal检测的时候，水质出现问题，会导致所有反应杯的平均值偏高，这时并不会颜色标记。但当水质恢复后，实时空白会远远低于当初的的水空白，也不会报警。但由上次水空白记录的数据计算的结果或试剂空白可能会出现负值，导致结果错误或试剂空白失败。所以说这是一个考虑点，如果想排除这个因素的干扰，做一次Photocal保存然后再执行一次保存即可。当然可以反推，这次的水质不好也会造成结果的混乱。 1.3 双波长校正：在使用双波长的项目里，主波长的吸光度减去付波长吸光度。 双波长校正公式是：ODP（x）=ODM（X）-ODS（X） ODP（X）是双波长校正后的吸光度值； ODM（X）是主波长的吸光度值； ODS（X）是付波长的吸光度值； X是0-27个读点。 1.4 试剂空白（Reagent Blank，RB）：以去离子水为样本，按照项目参数的设置进行测试，得到的整条曲线的各个读点的吸光度值，由于只有试剂参与，所以又叫试剂空白。试剂空白的吸光度值是经过水空白校正的，也就是说减去水空白值。 试剂空白也是经过双波长校正的，根据测试方法的不同而决定是否采用试剂空白校正。END1、RATE1和FIXED1这三种方法不使用试剂空白校正，这三种方法是采用的水空白校正。 试剂空白的校正公式是：ODR（x）=ODP（X）-RB（x） ODR（X）是试剂空白校正后的吸光度值； ODP（X）是双波长校正后的吸光度值； RB（X）是试剂空白吸光度值； X是0-27个点。  图3 试剂空白示意图 由于END、RATE、FIXED三种方法都采用试剂空白校正，所以试剂空白变得非常重要。不同厂家、不同批号甚至不同试剂瓶间的试剂空白可能会相差很大，所以在菜单Calibration Parameters定标参数里，Advanced Calibration选项有批号、换瓶等选项，更换批号或瓶号即会重新定标。而重新定标之前必须先做试剂空白。 试剂空白在定标参数里，可以单独测试，也可以与定标一起测试，但绝不可以单独做定标而不做试剂空白。 而有些实验室既不执行换瓶换批号定标，也不单独执行试剂空白，或者执行试剂空白时作为样本的去离子水有问题，导致保存在仪器内的试剂空白过高，由于不检查试剂空白范围，所以并不报警。但在样本测试或定标时导致负值出现。 所以在AU系列生化仪上，试剂空白和Photocal是经常要做的，是耽误了些时间，耗费了一些试剂，但保证了结果准确，还是值得的。每日开机，可以不做定标，但试剂空白是一定要做的。 试剂空白每次执行的次数可以最大到4次，一般要选择两次以上，这样可以看出重复性，继而推导仪器可能存在的问题。连续两次试剂空白则计算平均值，三次是取两次接近的值平均，四次的话则是去掉最大最小值，剩下的两次平均。 下图是站上上截取的一幅试剂空白的图：  图4 试剂空白示意图 由图可以看出，P0-P27所有读点的吸光度值都在数据库里保存。根据测试参数的设定，有三个主要值单独标示。P0就是R1加入的吸光度值，这个值理论上同瓶试剂不会改变，或者改变范围很小。Px是第一个测试点的值，如果只有单点，那就是这个点的吸光度。Py是最后一个点的吸光度。上图是ASO项目，END方法，读点分别是10和27，那么Px就是10点的吸光度，Py就是27点的吸光度。 批号和瓶号全部输入的是位置号，也就意味着不会变更，也就不会自动定标。 下图还是这个网友提问的图片，可惜拍照的不全：  图5数据监测常规界面示意图 由于只有14-27点的数据，那就有什么看什么了。而且是单波长，所以没有双波长校正。 图中的最大OD和最小OD分别是各个波长、反应吸光度和试剂空白的个点吸光度的最大最小值。 由于数据不全，我们看上图的试剂空白，最大OD出现在P12点，0.4079，而P11点更高是0.4093，但这一点不计数。最小OD值出现在P4点，0.0062。 而反应最大OD出现在P27点，0.4331。最小读点应该在P11点之前，图上显示是0.058，比试剂空白的最低点还要低。 反应OD是根据公式计算的，终点法大体是最后选择点的吸光度减去首先选择点的吸光度乘以液体比率系数。这个后面可能会有计算方法的解释。 下图是一个完整的数据监测界面：  图6 完整的数据监测常规界面示意图 这张所谓的完整图示，其实也没有13-27点的数据。不过屏幕左侧是完整的，上面清晰的告诉我们，样本测试的日期、校准日期、photocal日期和试剂空白日期。不过这个项目采用的END1方法，所以没有试剂空白数据。 这个结果的反应曲线如下：  图7 反应曲线示意图 上图绿色线条是付波长曲线，蓝色线条是主波长反应曲线，红色线条是反应曲线，也就是主波长减去付波长的拟合线，但图中没有设置显示。由于这是厂家说明书上的演示，所以measuring point-1 测量点1选择的是0-1，measuring point-2没有选择，因为是单试剂。这个读点选择的很有意思，P0点加入R1开始，加入样本后的第一点P1就结束，后面的曲线都是瞎忙活，早就测试完了。就算ALB反应快，但也不至于此。 2、测试方法：AU系列测试方法有终点法、速率法和固定点法。 2.1 终点法：终点法在测试方法选择里有END和END1两个选项。 END是试剂空白校正，也就是测定样本的吸光度值减去该点试剂空白的吸光度值。 END1是水空白校正，也就是测定样本的吸光度值减去该点水空白的吸光度值。 当然，二者都可以选择或者不选择双波长校正，而且二者都可以选择一组读点还是两组读点，以形成一点终点法还是两点终点法。  图8 一点终点法示意图  图9 两点终点法示意图 R1.V是R1试剂的体积； S.V是样本的体积； R2.V是R2试剂的体积； Pz是第一读点，也叫初始读点，在参数设置里是Measuring Point-1，在终点法里是R2之前之后各一个点； Px是第二读点，也叫最后读点，在参数设置里是Measuring Point-2，在终点法里不使用这组读点。 在如果不使用R2，也就是单试剂，是图8的示意图，第一读点一般选择0-27，第二读点不选择，这样结果会扣除R1的空白。如果选择END方法，则两个点都要减去该点的试剂空白后再相减。由于第一读点本来就是R1的空白，理论上应该与试剂空白P0的是数值相差无几甚至完全相等，所以只需要第二读点减去该点的试剂空白即可。 如果选择END1方法，那么两点的数值均要减去水空白。理论上水空白的曲线是一条水平直线，所以两点减去的值都相同，然后两点间再相减，得出的吸光度值用于浓度计算。 要注意的是：AU640和AU680对Measuring Point的概念是不同的，前者Measuring Point-1是主读点， Measuring Point-2是前一点，也就是空白点。而后者正好相反。Measuring Point两组点都选择，是给双速率法和双固定点法准备的，终点法用不上。 在图9中，是双试剂终点法，需要试剂样本空白，也就是R1+S的空白，所以第一读点的Fist应该在R2加入之前的一个点，也就是图中的Pz，一般选择P10读点；Px则是第一读点的Last点，反应结束的点。 终点法的反应OD值计算公式是： 反应OD=（Px-K2*P0）-（K3*Pz-K2*P0） K2是R1体积和总反应量的比值，也就是R1.V/（R1.V+S.V+R2.V）； K3是R1+S的体积和总反应量的比值，也就是（R1.V+S.V）/（R1.V+S.V+R2.V）。 图5中的光路校正其实就是这个K值，由于参数不全，无法计算反推罢了。 如果选择是END方法，而且Measuring Point-1的都选择上的话，那就是两点终点法扣除试剂空白，公式就成为：反应OD=（Px-RBPx）-K3（Pz-RBPz） 也就是各点的吸光度值减去各点的试剂空白吸光度值，再进行体积系数校正。 如果选择是END1方法，而且Measuring Point-1都选择上的话，那就是两点终点法扣除水空白，公式就成为：反应OD=（Px-WB）-K3（Pz-WB）=Px-K3Pz 我们常常习惯使用测量点吸光度值减去水空白（或者杯空白）的方法，并不习惯减去试剂空白，所以END1方法在国内采用的很多。而END减去试剂空白的方法，由于试剂原因和执行时间的问题导致一些结果出现负值，特别是低值标本。 闹得沸沸扬扬的免疫比浊项目用终点法都在R2之后的问题，大可不必使用两点终点法，直接使用一点终点即可，只设置Measuring Point-1（例如：Fist0-Last27）。而非要使用两点终点法，那就只能R2之前之后各一组点，这毫无疑问 见过很多实验室里的试剂空白都是空的，根本不做，因为方法都采用END1、RATE1和FIXED1。 在终点法当中，无论采用一点还是两点，亦或是END还是END1，都有一个先天不足，那就是样本本身的空白无法排除，有的样本本身的颜色就很深，加入试剂后反应度很小，可能会造成假阳性。为了解决这个问题，AU可以采用样本空白校正（sample blank correction）。 在菜单Parameters>Common Test Parameters>Test Name中，选择点击下面的Sample Blank，就会出现样本空白界面，一共只能选择10个项目，分别选择每一个项目的颜色和空白项目名称，然后保存。在进行这个项目测试的时候，就会先占用一个反应杯，用去离子水做试剂稀释样本进行样本本身颜色的比色（样本空白），然后再占用一个反应杯，用参数设定的试剂进行比色（颜色反应），最后颜色反应的吸光度值减去样本空白的吸光度值。 样本空白的计算公式是：反应OD=ODC-K*ODB ODC是该点的颜色反应吸光度值； ODB是该点的样本空白吸光度值； K是样本空白体积和颜色反应体积的比值，一般是1。 根据END或END1方法的不同，还要分别减去该点的试剂空白或者水空白。下图就是样本空白校正的示意图：  图10 样本空白校正示意图 2.2 速率法 Rate：AU中， 有Rate和Rate1两个速率法选项。 Rate，是扣除试剂空白的速率法； Rate1，是扣除水空白的速率法； 速率法可以使用单速率法和双速率法两种方法。  图11 速率法示意图 当使用单速率法时，只有上图的△OD2，参数中只选择Measuring Point-1就行了，给出开始和结束的两点，仪器根据这两点计算每分钟吸光度变化。这也是最常用的速率法。 当使用双速率法时，就要在R2加入之前选择两个点，作为Measuring Point-1的值，然后在Measuring Point-2里输入R2之后的两个点，这样前者是△OD1，后者是△OD2，计算公式时： 反应OD=（△OD2-△OD1）/min 当然，Rate方法要减去各点的试剂空白再计算△OD，Rate1要减去水空白再计算△OD。 与终点法一样，大多采用Rate1方法。 线性范围（Linearity Limit）：在速率法当中，线性检查是必要的。根据速率法选择的读点数不同，系统将全部读点一分为二，分前半程和后半程两部分分别进行△OD/min计算，然后二者再进行公式计算。  图12 速率法线性检查示意图 前半程的△OD/min为△E1，后半程的△OD为△E2，在菜单参数设置里面有个Linearity Limit选项， [|（△E1-△E2）|÷|（△E1+△E2）/2|]*100≤Linearity Limit为正常线性，否则判断为线性错误，结果有*号提示。这是第一个线性判断依据。 第二个线性判断依据是|（△E1-△E2）|≤0.003，否则也会判断为线性错误。这个0.003是系统默认值。也就是说前半程和后半程的△OD/min差值绝对值不能超过0.003（Q键菜单中的Decision of Linearity Check设置）。 逆向反应检查（Reverse Reaction Check）：在速率法反应中，逆向检查也很有必要，如果在读点范围内有任何一个点出现反转，哪怕是整个读点区的反应趋势没有改变，都会被监测到，在结果中用* 号提示。  图13 逆向检查示意图 检查公式是： 正反应 （Pn-Pn+1）/2＞0.002 负反应 （Pn+1-Pn）/2＞0.002（Q键菜单中的Decision ofReaction设置） 所以，当结果出现*号提示时，有两个方面需要考虑，可能是某一点颠倒了方向，也可能是线性不好。 LAG-TIME(延迟时间)：在速率反应中，有些反应速度过快，导致在读点区有2个以上的点没有读数，例如典型的底物过剩反应。这样选择是否进行延迟读点，系统可以选择延迟后读点进行计算。这个功能要与OD Limit里的MIN OD和MAXOD配合使用。 当下降反应开启了LAG-TINE和设置了ODLIMIT的Min OD，速率反应低于Min OD设置值时，结果会用B提示。 当上升反应开启了LAG-TINE和设置了ODLIMIT的MAX OD，速率反应高于MAX OD设置值时，结果会用D提示。  图14 速率反应过快示意图 图中的a线是正常速率曲线，b和c都过快，而且低于Min OD设置的0.5的范围。 在速率法当中，也可以选择使用样本空白校正，利用单独的反应杯进行样本空白比色，然后再相减。 动态范围（Dynamic Range）：在速率法中，读点区域两点间的吸光度变化也要被监测，不然会漏报高浓度样本。而高浓度样本不完全会造成底物过剩。所以在动态范围里设置最低最高吸光度，用来监测两点间的吸光度变化。超过高值限制则用F提示，超过低值限制则用G提示。 2.3 固定点法（FIXED）：在AU中，有FIXED和FIXED1两个选项。也叫做两点法。 FIXED，是扣除试剂空白的固定点法； FIXED1，是扣除水空白的固定点法； 固定点法都可以采用单固定点和双固定点法。也可以进行样本空白校正。  图15 固定点法示意图 反应OD的计算公式是： ΔOD = (Px - Py) - K1 X (Pw - Pz) K1是体积校正系数，(R1 +S)/(R1 + R2 + S) ； Px, Py MeasuringPoint-2的第一点和最后一点的吸光度值； Pw, Pz MeasuringPoint-1试剂样本空白的第一点和最后一点吸光度值。 由于固定点法仅仅是主读点区两点间的差值，而且都在R2之后，所以无论终点法还是速率法都可以这个使用。 而闹得沸沸扬扬的免疫比浊项目用终点法都在R2之后的问题，换成这个方法即可，也可以说选点没有问题，问题出在方法上。而采用这个方法，Measuring Point-1和Measuring Point-2的间隔要相当远才行。例如，单固定点法一般这样选择：Measuring Point-1 Fist12， Last27；双固定点法一般这样选择：Measuring Point-1 Fist2， Last10；Measuring Point-2 Fist12， Last27； 3. 定标方法：分为ACAL自动定标和MCAL人工定标两大类。ACAL可分为AA、AB和7AB三小类，MCAL可以分为MB和7MB两个小类。 3.1 ACAL 自动定标：根据给定的定标液位置和浓度，以及计算公式进行的自动定标曲线绘制。 ACAL AA：是两点线性定标，给出两个定标液浓度，自动计算绘制一条直线（线性定标的曲线）。这种方法适用于零浓度值不过原点的定标，也就是说有截距。 ACLA AB：是单点线性定标，只需要给出一个定标液浓度，自动计算绘制一条经过原点的定标曲线。 根据直线公式：Y=KX+B得知，K为直线的斜率，B则是截距。  图16 AA和AB定标曲线示意图 上图坐标系是扣除水空白的，也就是说不考虑水空白的因素。 如果选择了END1、Rate1和FIXED1这些扣除水空白的测试方法，又是线性定标的话，直接选择AB即可。如果选择AA，则会出现一个零浓度截距ODa，也就是试剂空白，当试剂改变，出现波动的话，可能低值标本会出现负值。因为有可能试剂空白发生改变，低于定标时很多，这样低值样本的OD会低于ODa很多，AA直线延长下来，浓度X轴的值就是负的，到了第二象限去了。 如果选择了END、Rate和FIXED这些扣除试剂空白的测试方法，又是线性定标的话，直接选择AA定标即可。因为每次定标前必须执行试剂空白测定，这个截距会自动被试剂空白校正过来，这样就会把X轴移动到X1位置，相当于AA也是过了修正后的原点。如果这个时候选择AB方法，则很有可能低值标本的吸光度是负值的情况下才能得出低值浓度，到了第四象限去了。 所以说，测试方法和定标方法要结合使用才能达到最佳的状态，并不是绝对的哪一个方法负值概率就低。 无论是试剂空白校正还是水空白校正，前提是要经常做试剂空白和水空白，不然依旧会导致负值出现。 ACAL 7AB：是多点线性或多点非线性定标，最多7个点，最少2个点，默认零浓度点为原点。  图17 7AB定标曲线示意图 7AB定标可选择的公式很多，后面会单独介绍计算公式。 3.2 MCAL 人工定标：根据跟定的数据绘制定标曲线，而不需要定标液。 MCALMB：给出线性定标的直线斜率，也就是K值，默认是过原点的。 MCAL7MB：多点定标，最多7个点，最少两个点。但每两个点间的斜率要人工给出，也就是说只能给出折线，做不了弧线。  图18 MCAL MB和7MB示意图 由此可以看出，MCAL是最不靠谱的定标方法，能不采用就不采用。 3.3 定标公式（Fomula）：与定标方法配合使用，确立定标曲线的绘制方法。 在菜单Parameters>Calibration Parameters>CalibrationSpecific中，会见到下面的图：  图19 AU定标参数界面 上图中CalibrationType里就是选择刚才所讲的定标方法，Fomula就是计算公式。 Straight Line 直线线性，公式是：y = Ax 或 y = Ax + B Polygonal Line 折线，公式是：y =Anx + Bn Quadratic Type 二元二次方程，公式是：y = Ax2 + Bx + C Tertiary Type二元三次方程，公式是：y = Ax3 + Bx2 + Cx + D Tertiary Type (ReversedFunction) 反转的二元三次方程，公式是： x = Ay 3 + By 2 + Cy + D EIA-TYPE 1 对数曲线Logit-Log4P EIA-TYPE 2 对数曲线Logit-Log5P EIA-TYPE 3 指数函数曲线 EIA-TYPE 4 可能是同工酶多点线性 Spline 样条曲线  图20 |
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企鹅 发表于 2014-9-9 16:13
非常感谢郑工详细讲解！
动态范围（Dynamic Range）是要输吸光度，不是指的测定范围啊？好多厂家都输 ...
yxiaoyao 发表于 2014-9-7 14:37
辛苦了。。。。学习了
拟合曲线校正 有点模糊 有实例讲解就好理解些，，，，谢谢 ...
郑振寰 发表于 2014-9-9 16:43
选择线性检查的话，动态范围是吸光度，两点最高最低的吸光度。不选择线性检查，可输入试剂能够测试的最大 ...
企鹅 发表于 2014-9-10 08:58
AU640上试过，ALT,Linrarity：30，Dynamic Range：5-1600，结果没有F/G报警，应该指的是吸光度变化范围吧 ...
